枯草芽孢桿菌XF-1對十字花科作物體內異硫氰酸苯乙酯含量的影響

張照然,何朋杰,李興玉,何鵬飛,吳毅歆,范黎明,何月秋**

(1.遼寧省撫順市農業(yè)科學研究院,遼寧 撫順 113300;2.云南農業(yè)大學 植物保護學院,云南 昆明 650201;3.云南農業(yè)大學 基礎與信息工程學院,云南 昆明 650201;4.云南農業(yè)大學 農學與生物技術學院,云南 昆明 650201;5.微生物菌種篩選與應用國家地方聯(lián)合工程研究中心,云南 昆明 650217)

硫代葡萄糖苷是植物體內合成的一類含氮次級化合物,以十字花科植物體內的硫代葡萄糖苷含量最高[1]。所有硫代葡萄糖苷都由一個含糖基團、硫酸鹽基團和可變的非糖側鏈(R)組成。基于R基團的不同,硫代葡萄糖苷可以分為3類:脂肪族硫代葡萄糖苷、芳香族硫代葡萄糖苷和吲哚族硫代葡萄糖苷[2]。硫代葡萄糖苷經植物黑芥子酶水解后可以產生一系列具有生物活性的水解產物,如異硫氰酸酯(ITCs)、硫氰酸酯(TCs)和腈類(nitriles)等化合物[17]。異硫氰酸酯具有較高的生物活性,如對大腸埃希菌屬、沙門菌屬、金黃色葡萄球菌等都具有很強的殺菌力[3]。

十字花科根腫病是世界范圍內的毀滅性土傳植物病害,受到根腫菌侵染后的植株主根或側根薄壁組織膨大或形成腫瘤。根腫病菌在土壤中可存活10年以上,田間土壤一旦受到根腫病菌的污染,就不再適宜栽培十字花科蔬菜[4-5]。在已知的研究中,植物體內的硫代葡萄糖苷的含量和種類與根腫病的發(fā)生有著密切的聯(lián)系[6]。目前針對十字花科根腫病主要的防治方法為農業(yè)防治、化學防治和生物防治。其中農業(yè)防治和化學防治都有明顯的弊端,而生物防治作為一種新型的防治手段正在逐步興起。云南農業(yè)大學何月秋團隊從白菜根腫病病田中分離得到1株枯草芽孢桿菌BacillussubtilisXF-1,其對十字花科根腫病具有良好的防治效果[7]。本實驗室的研究人員在前期試驗中已從十字花科植物的根部分離出一種異硫氰酸酯類化合物,經GC-MS和HPLC鑒定為異硫氰酸苯乙酯。本試驗從生防菌與十字花科作物的互作入手,研究了十字花科作物體內異硫氰酸苯乙酯含量的變化,以期進一步明確生防菌的防病機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XF-1(后文簡稱為XF-1),由云南農業(yè)大學農業(yè)生物多樣性應用技術國家工程中心分離并保存。

供試十字花科作物:大白菜(Brassicarapa)，品種為魯春白1號；油菜(Brassicanapus)，品種為金油1306；大頭菜(Brassicajuncea)，品種為特選；紅菜苔(Brassicacampestris)，品種為紅衣少女；花椰菜(Brassicaoleracea)，品種為昆明90天；蘿卜(Raphanussativus)，品種為松太蘿卜；水果蘿卜(Raphanussativus)，品種為日本水果蘿卜。各作物的種子均購于昆明龍頭街農貿市場。各種子在恒溫光照培養(yǎng)箱內催芽后,選取長勢一致的6株幼苗，種植于同一規(guī)格(16 cm×12 cm)的營養(yǎng)缽內；每個品種各選取10盆幼苗,種植于溫室大棚內。在試驗期間,每天早晚各澆水1次,并旋轉1次花盆(防止邊際效應);在試驗期間不噴灑任何農藥。

1.2 試驗方法

1.2.1 XF-1菌株發(fā)酵液的制備 在LB固體培養(yǎng)基上活化供試的XF-1,在37 ℃下培養(yǎng)72 h后用接種環(huán)挑入盛有40 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內,置于180 r/min恒溫搖床中37 ℃培養(yǎng)24 h,作為種子液；吸取5 mL種子液到盛有250 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶內,采用相同條件擴大培養(yǎng)72 h。在制備完成后稀釋調制成1×107cfu/mL的接種液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生防菌株XF-1的接種 于播種后第7天,分別將XF-1接種液和相同稀釋倍數(shù)的LB液體培養(yǎng)基澆灌至營養(yǎng)缽中,每缽50 mL,共處理4次,每7 d接種1次。

1.2.3 植株根系內ITCs的提取 HPLC分析儀器與藥品：安捷倫公司的Agilent 1260工作平臺,分析柱為SB-C18 Analytical HPLC Column 4.6 mm×250 mm；異硫氰酸苯乙酯標準品，購于Sigma-Aldrich公司,純度為色譜純；流動相中的水為超純水,乙腈為色譜純。

標準品溶液的配制:精確稱取異硫氰酸苯乙酯標準品10 mg,用乙腈溶解,并定容至50 mL，稀釋后濃度為0.2 μg/μL；將其轉移至棕色樣品瓶中備用。

樣品的采集與處理:取第一次接種XF-1后培養(yǎng)30 d的十字花科作物根部組織各10 g,在研缽研磨后轉至容量瓶中,用甲醇定容至50 mL,靜置2 h后,過0.22 μm的有機濾頭,將濾液裝入1.5 mL的色譜樣品瓶中,用于HPLC的檢測。

樣品中ITCs含量的HPLC分析：參照Lim等[16]的方法,略有改動。紫外檢測器使用的波長為246 nm,柱溫30 ℃,進樣量為10L。流動相A為色譜純乙腈,流動相B為超純水；在20 min內流動相A由20%的乙腈升至100%的乙腈,流速為1 mL/min。

1.2.4 十字花科作物根系內黑芥子酶活力的測定 參照Li等[15]的方法。取第一次接種XF-1后培養(yǎng)30 d的各十字花科作物根部組織1.5 g,剪碎后加入10 mL的提取緩沖溶液,冰浴研磨,渦旋振蕩后以12000 r/min離心30 min,回收上清,作為酶提取液備用(酶液可置于-80 ℃冰箱內短期保存)。

將2.05 mL反應體系溶液置于1 cm光路石英比色杯中,在37 ℃條件下混合平衡1 min,向反應體系溶液中添加20L酶提取液，然后靜置7 min,于37 ℃反應10 min,測定227 nm波長處的吸光度,計算酶活力,所有樣品重復3次。在一定條件下,單位材料(鮮重)每分鐘降解1mol底物黑芥子硫苷酸鉀的酶量為一個酶活力單位(U/mg),其計算公式如下:U=(N×VEX)/(VE×t×mF)。式中N為反應時間內黑芥子酶降解黑芥子硫苷酸鉀的量(μmol);t為反應時間(min);VE為酶液體積(mL);VEX為提取液體積(mL);mF為材料鮮重(mg)。

2 結果與分析

2.1 澆灌XF-1對植株根系內異硫氰酸苯乙酯含量的影響

2.1.1 異硫氰酸苯乙酯的線性分析 取適量標準品溶液,分別按0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg依次進樣,在1.2.3的色譜條件下測定異硫氰酸苯乙酯的峰面積。以樣品的進樣量(X)為橫坐標,以峰面積(Y)為縱坐標,得到回歸方程Y=353202.28X+2.4209217,r=0.9999。結果表明,當異硫氰酸苯乙酯的進樣量在0.4～2.0 μg范圍內時,峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.1.2 異硫氰酸苯乙酯的HPLC檢測結果 HPLC檢測結果(表1)表明：在供試的7種十字花科蔬菜中，對照組的異硫氰酸苯乙酯含量以蘿卜屬中的白蘿卜和水果蘿卜居前兩位,分別為2.369和0.674 mg/g；生防菌XF-1處理組的異硫氰酸苯乙酯含量均比對照組有所提高,以大頭菜的異硫氰酸苯乙酯含量增長最明顯，增長率達122.09%，而增長率最低的是大白菜,僅為3.97%。

表1 經XF-1處理后十字花科作物根系內異硫氰酸苯乙酯含量的變化

2.2 澆灌XF-1對植株根系內黑芥子酶活性的影響

2.2.1 黑芥子硫苷酸鉀的標準曲線 分別取25.18 mmol/L的黑芥子硫苷酸鉀標準品0、12.5、25.0、37.5、50.0、70.0 μL,用緩沖液將其定容至2.07 mL,測定其在227 nm波長處的吸光度。以濃度x(mmol/L)為橫坐標,以吸光度y為縱坐標繪制標準曲線。計算得到黑芥子硫苷酸鉀標準曲線的回歸方程:y=6.7114x+0.0378,r=0.9972,表明濃度與吸光度呈極顯著的正相關。

2.2.2 黑芥子酶活性的變化 經生防菌株XF-1處理后,各十字花科作物根系內黑芥子酶的活性均較對照有不同程度的提高,其中大白菜提高了51.09%,油菜提高了61.69%,紅菜苔提高了26.53%,大頭菜提高了12.31%,蘿卜提高了68.33%,水果蘿卜提高了5.27%,花椰菜提高了44.81%(圖1)。

3 討論

蕓薹根腫菌可以引起十字花科植物和某些非十字花科植物根腫病的發(fā)生,但發(fā)病的嚴重程度與植物體內的硫代葡萄糖苷的含量和種類有著密切的聯(lián)系,在某些含有硫代葡萄糖苷的非十字花科作物上,蕓薹根腫菌可以引起該植物根部腫大[6]。在十字花科植物中,接種蕓薹根腫菌后,未發(fā)病或發(fā)病程度較輕的植物體內主要含有芳香族硫代葡萄糖苷,不含或很少含有吲哚族硫代葡萄糖苷;在發(fā)病較重的植物體內含有脂肪族和吲哚族硫代葡萄糖苷,其中吲哚族硫代葡萄糖苷含量較高[6,8]。在不同的十字花科植物體內,吲哚族硫代葡萄糖苷都被發(fā)現(xiàn)是生長素合成的前體物質,同時其含量在根部腫瘤的形成過程中也有一定的變化[9]。

在十字花科植物中,體內的硫代葡萄糖苷-黑芥子酶是一種重要的植物保衛(wèi)系統(tǒng)[18-19],當植物受到外部機械力的作用或病原菌侵染時,該系統(tǒng)會發(fā)揮作用,降解硫代葡萄糖苷產生異硫氰酸酯(ITCs)、硫氰酸酯(TCs)和腈類(nitriles)等化合物,其中硫氰酸酯類化合物具有較高的抗菌活性,可以抵御病原菌的侵襲。同時,該系統(tǒng)是十字花科植物抵御菌核病和根腫病的保衛(wèi)系統(tǒng)[20-21]。本試驗測定了生防菌XF-1處理幾種十字花科植物前后植株體內的異硫氰酸苯乙酯含量,發(fā)現(xiàn)對照組的蘿卜和水果蘿卜具有較高的異硫氰酸苯乙酯含量。據(jù)有關報道，蘿卜屬植物的根腫病發(fā)病率較低,并且具有較高的抗性[10-11],這與本試驗檢測到的蘿卜屬內異硫氰酸酯的含量較高的結果基本一致。當植物感染根腫菌后,其體內的黑芥子酶被誘導表達,去水解相應的硫代葡萄糖苷,產生具有一定抗菌生物活性的異硫氰酸酯類化合物[9]。在本試驗中,經生防菌XF-1處理后,十字花科植物體內的黑芥子酶的活性均有不同程度的提高,同時檢測到十字花科植物體內異硫氰酸苯乙酯的含量也相應提高。但在十字花科植物體內異硫氰酸苯乙酯含量的提高幅度與黑芥子酶活性的提高幅度并沒有表現(xiàn)出良好的相關性,這可能與本試驗只檢測了硫代葡萄糖苷的單一酶解產物(異硫氰酸酯類)有關。酶解產物異硫氰酸酯含量的升高,也可能是生防菌XF-1直接降解的結果。此前曾有報道稱硫代葡萄糖苷可以被某些微生物直接降解,產生一系列的活性化合物[17]。也有可能XF-1提高了黑芥子酶的活性,從而促進了硫代葡萄糖苷的水解,產生大量的抗菌活性物質來抵御根腫菌的侵入。據(jù)Rengasamy等[19]報道，將一種褐藻提取物噴施于十字花科植物可以引起植物黑芥子酶活性的提高,以抵抗蚜蟲的侵害。這與本試驗用生防菌XF-1防治十字花科植物根腫病的過程相似。由于生防菌XF-1的體積比根腫菌小[12-13],且XF-1是1株十字花科植物的內生菌,因此更容易進入植物體內,從而誘導植物的抗性,減輕根腫病的發(fā)生程度。

圖1 經XF-1處理后十字花科作物根系內黑芥子酶活性的變化