高聚合度麥麩阿魏酸糖酯組分對美拉德反應產物抑制作用研究

趙文紅，馮麗然，陳 暉，楊國龍

河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

谷物中的酚酸可以通過相互結合或協同增效起到抗氧化作用[1]。其中，酚酸與碳水化合物的結合是重要的存在形式[2]，如麩皮中的阿魏酸低聚糖酯(FOs)，它以不同聚合度低聚糖的糖羥基與阿魏酸(FA)羧基酯化的形式存在(圖1)。通過酶水解麥麩可以制備FOs。Smith等[3]用Oxyporus纖維素酶水解小麥麩皮細胞壁得到了阿魏?；⒗咎?。Ralet等[4]用黑曲霉中的阿魏酸酯酶降解麥麩中的阿魏酸低聚糖酯，在其消化液中分離出了阿魏酰基阿拉伯木二糖和木三糖。據報道，FOs的水溶性好，熱穩定性高，能促進雙歧桿菌的增殖[5]，在自由基清除[6]、油脂抗氧化[7]和蛋白質非酶糖基化[8]等方面表現出很強的抗氧化活性。美國在2010年以麥麩提取物的名義批準將其作為食品添加劑(FDA, GRAS Notice 000343)使用[9]。

(5-O-FA-α-L-Ara)-(1→3)-[O-β-D-Xyl]n圖1 阿魏酸糖酯基本結構Fig.1 Basic structure of feruloylated oligosaccharides

α-二羰基化合物是美拉德反應中形成風味化合物的重要中間物質，同時也是反應性極強的糖基化劑[10]，參與美拉德反應AGEs的形成[11]，從而對蛋白質組和基因組造成損傷[12]。其中，GO、MGO和2, 3-BD作為α-二羰基化合物，對人體危害極大[13]，能夠引起乳糖不耐癥和氧化應激等反應[14]。此外，身體內的AGEs對健康的危害十分廣泛，包括引起動脈粥樣化、胰島素抵抗、糖尿病并發癥、骨質疏松、衰老等[15]。已有研究表明，FA能夠通過清除美拉德反應過程產生的自由基、抑制美拉德產物的形成或者直接與美拉德反應中間產物形成加合物等方式影響美拉德反應[16]。因此，研究抗氧化劑對美拉德反應產物的抑制作用具有現實意義。FOs這種新型的功能性添加劑對美拉德反應產物形成的影響研究鮮見相關報道。

作者采用凝膠層析技術制備得到組分F1，通過模擬美拉德反應體系，研究F1對美拉德反應產物的抑制作用。以期為高活性FOs的篩選與制備提供理論依據，促進FOs在食品特別是高溫焙烤食品等方面的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：鄭州金苑面業有限公司；谷朊粉：高要市蜜丹兒商貿有限公司；聚苯乙烯標準品：上海源葉生物科技有限公司；Sephaden LH-20凝膠：索萊寶生物科技有限公司;甘氨酸、乙二醛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；2, 3-丁二酮：山東西亞化學股份有限公司；丙醛酮：上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二胺：天津市大茂化學試劑有限公司；乙腈和冰乙酸為色譜純試劑，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-6100S紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；RE-6000A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠;1260 InfineityⅡ高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；F-7000熒光分光光度計：日本日立高新技術公司；7890氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司;LGJ-10C冷凍干燥機：北京四環科學儀器廠有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 F1的制備

F1的制備見文獻[17]。收集合并第一個吸收峰對應的洗脫液，濃縮后冷凍干燥即得F1。

1.3.2 F1的紫外光譜分析

采用紫外可見分光光度計在220～400 nm掃描范圍內對色譜凝膠柱分離得到的F1和標準FA樣品進行紫外全波長掃描，得到圖譜,進行組分的定性鑒別。

1.3.3 F1結構組成的分析

將不同分子質量(分別為210、580、850、1 300、1 780 Da)的聚苯乙烯標準品用1.0 mL四氫呋喃溶解后加入25%乙醇溶液配制成2.0 mg/mL的標準溶液。在Sephadex LH-20層析柱中用四氫呋喃與25%乙醇(體積比為1∶ 10)的混合溶液作洗脫液，以0.5 mL/min的流速洗脫，測定每種標準品的保留時間，以保留時間為橫坐標，標準品分子質量為縱坐標，作標準曲線，得到聚苯乙烯平均分子質量與保留時間的方程。

將分離得到的F1樣品(6 mL)上樣于同一個Sephadex LH-20柱中，用25%乙醇溶液以0.5 mL/min的流速洗脫，得到相應的洗脫圖譜，讀取相應組分的保留時間。按照上述方程計算得到該組分的平均分子質量。并結合F1的GC、HPLC和紅外光譜結構表征結果[18]，解析其組成。

1.3.4α-二羰基化合物的HPLC檢測

對α-二羰基化合物進行HPLC分析，需要先進行衍生化，生成喹喔啉衍生物[19]。分別配制質量濃度均為2、4、10、20、40、100 μg/mL的GO、MGO和2, 3-BD，分別取2.0 mL上述溶液于試管中，加入2.0 mL鄰苯二酚(0.6%)后置于60 ℃水浴鍋中反應4 h進行衍生化處理，以生成相應的喹喔啉、2-甲基喹喔啉和2-(2, 3, 4-三羥基丁基)-喹喔啉。反應結束后反應液過0.45 μm有機濾膜，然后進行HPLC檢測分析。

HPLC檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；流動相為V(乙腈)∶V(0.1% 醋酸溶液)=0.30∶0.70；流速為1.0 mL/min；檢測波長為315 nm；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。之后分別分析3種α-二羰基化合物的質量濃度與對應峰面積的線性關系。

1.3.5 F1對α-二羰基化合物的抑制率的測定

參考姚勝文[20]和黃啟瑞[21]的方法及其優化后的條件，經過適當修改，利用葡萄糖和谷朊粉構建美拉德反應體系。以0.1 mol/L檸檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液配制pH 8.0的緩沖溶液。準確稱取7.0 g葡萄糖于燒杯中，用pH 8.0的磷酸緩沖液溶解后轉移至100 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液。用pH 8.0的磷酸緩沖液配制50 mg/mL的F1溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入緩沖液使終體積為1.0 mL，分別向比色管中加入10 mL葡萄糖溶液和0.3 g谷朊粉(忽略谷朊粉對反應體系體積的影響)，充分混勻后放入預先已經升溫至120 ℃的烘箱中反應60 min，結束后立刻放入冰水浴中終止反應。反應液定容至15 mL轉移至離心管中，5 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL于干凈試管中，加入2.0 mL鄰苯二酚，60 ℃水浴4 h進行衍生化，反應結束后過0.45 μm有機濾膜進行HPLC檢測(檢測條件同前)，以FA為對照，每組重復3次。檢測結果與GO、MGO和2, 3-BD的出峰時間作對比，積分得到相應峰面積，依據相應的α-二羰基化合物的標準曲線計算得出相應濃度，并按照公式(1)計算F1對α-二羰基化合物的抑制率。

(1)

式中：C0為反應混合物中不含F1時α-二羰基化合物的質量濃度，μg/mL；C1為反應混合物中含有F1時α-二羰基化合物的質量濃度，μg/mL。

1.3.6 F1對AGEs的抑制率的測定

參考康世墨[22]的方法并經過適當修改，利用葡萄糖和甘氨酸構建美拉德反應體系。分別稱取4.0 g葡萄糖和3.0 g甘氨酸于燒杯中，用pH 8.0的磷酸緩沖液(0.2 mol/L)溶解后轉移至50 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液和60 mg/mL的甘氨酸溶液。用pH 8.0的磷酸緩沖液配制50 mg/mL的F1溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入緩沖液使終體積為1.0 mL，分別向比色管中加入2.5 mL葡萄糖溶液和2.5 mL甘氨酸溶液，充分混勻后放入預先已經升溫至80 ℃的恒溫水浴鍋中反應1.5 h，結束后立刻放入冰水浴中終止反應。蒸餾水定容反應液至10 mL，然后用熒光分光光度計檢測樣液的熒光響應值，以FA為對照，每組重復3次。熒光分析條件為激發波長370 nm，發射波長440 nm。根據不同質量濃度F1反應體系的熒光強度大小，利用公式(2)計算F1對AGEs的抑制率。

(2)

式中：AU0為反應混合物中不含F1時的熒光強度，a.u.；AU1為反應混合物中含有F1時的熒光強度，a.u.。

1.3.7 數據統計與分析

試驗數據采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，以x±s表示結果，組間比較采用多因素方差分析，組內比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 F1的結構特征分析

F1和FA經紫外全波長掃描，見圖2，結果顯示在325 nm左右出現最大吸收峰，并且峰形出現一定紅移。Jankovska等[23]的研究表明未水解的酯化阿魏酸紫外吸收光譜會出現一定程度的紅移。結果表明F1結構中含有結合型的阿魏酸結構。同時，課題組此前將F1組分堿水解后經HPLC法檢測,顯示其含有阿魏酸組分；紅外光譜分析顯示F1組分在1 735 cm-1附近有吸收峰，表明酯鍵的存在，896 cm-1左右的吸收峰表明β(1-4)吡喃糖苷鍵的存在；GC法檢測F1組分糖體組成為阿拉伯糖和木糖[18]。研究結果表明：F1組分為阿魏酸通過酯鍵連接在阿拉伯木糖糖體上的糖酯結構。

圖2 Sephadex LH-20凝膠柱洗脫組分F1和FA的紫外全波長掃描圖譜Fig.2 Ultraviolet full-wavelength spectra of eluted fractions F1 and FA with Sephadex LH-20 gel column

2.2 F1的結構組成分析

不同分子質量聚苯乙烯標準品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜見圖3a，在該試驗條件下，聚苯乙烯分子質量與保留時間之間的回歸方程為y=-712.1ln x+4 484.5，其分子質量與保留時間有良好的相關性，決定系數達到0.989 8。分子質量-保留時間擬合曲線見圖3b。F1在此色譜條件下的出峰時間為(52±2) min，根據方程計算可知該樣品的平均分子質量為(1 671.17±27.40) Da。據前期研究：GC法檢測麥麩F1組分糖體組成中阿拉伯糖和木糖的摩爾比為1∶ 9.46；DNS法測定F1組分的平均聚合度為10.9[17]，推測F1可能的結構組成為FA-ara-(xly)9，即含有9個木糖個數的阿魏酸糖酯。經計算該組分的分子質量為1 675.49 Da，該結果與Sephadex LH-20凝膠色譜柱的平均分子質量檢測結果一致。

圖3 聚苯乙烯標準品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜及其分子質量-保留時間曲線Fig.3 Gel column elution profile of polystyrene standard and its molecular weight-retention time curve

2.3 F1對模擬體系中間產物α-二羰基化合物生成的影響

2.3.1 3種α-二羰基化合物的HPLC分析與線性分析

美拉德反應產物α-二羰基化合物經鄰苯二胺衍生化生成喹喔啉后可利用HPLC法檢測。3種α-二羰基化合物的HPLC圖譜見圖4。由圖4可知，GO、MGO和2, 3-BD的出峰時間分別為4.277 min、5.068 min、6.247 min(2.082 min左右的峰為鄰苯二酚的特征峰)。

由圖4可進一步分析3種α-二羰基化合物的質量濃度與對應峰面積的線性回歸關系，結果見表1。在2～100 μg/mL范圍內，此線性回歸方程的R2均在0.999 9以上，最低檢測限為10 ng/mL。結果表明：3種α-二羰基化合物標準曲線的線性關系良好，可進行組分F1對模擬體系中的3種美拉德反應產物α-二羰基化合物的影響研究。

2.3.2 F1對3種α-二羰基化合物生成的影響

以FA為對照，研究F1對美拉德反應中間產物α-二羰基化合物的影響，結果見圖5。

圖5 F1和FA對α-二羰基化合物的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of F1 and FA on α-dicarbonyl compounds GO, MGO, and 2, 3-BD

從圖5的整體走勢看，F1和FA對美拉德反應產物GO、MGO和2, 3-BD這3種α-二羰基化合物的生成均具抑制作用，且其抑制率隨著質量濃度的增加呈上升趨勢。

由圖5a可知，當質量濃度為10 mg/mL時，FA促進GO的生成。隨著質量濃度的升高，F1和FA對GO的抑制率升高，經過統計學分析發現，F1對GO的抑制率顯著優于FA(P<0.05)；當質量濃度為50 mg/mL時，F1和FA對GO的抑制率分別為63.64%和57.18%，其抑制率無顯著性差異(P>0.05)。在美拉德反應過程中，糖分子的碳鏈裂解會形成GO，該過程中會有羰自由基、羥自由基等的生成，而F1具有優良抗氧化能力[24]，因此,能夠清除這些自由基從而抑制GO的形成。

由圖5b可知，當質量濃度為50 mg/mL時，F1和FA對MGO的抑制率分別為46.65%和33.49%，經SPPS分析，F1質量濃度對抑制MGO的生成具有顯著影響(P<0.05)，同時FA對MGO的抑制率顯著低于F1(P<0.05)。F1對MGO的抑制效果優于FA。

由圖5c可知，隨著質量濃度的升高，F1和FA對模擬體系中2, 3-BD的抑制率逐漸升高。當質量濃度為50 mg/mL時，F1和FA對2, 3-BD的抑制率分別為76.74%和64.85%，經過統計學分析發現，F1質量濃度對抑制2, 3-BD的生成具有顯著影響(P<0.05)，F1和FA對2, 3-BD的抑制率不存在顯著差異(P>0.05)。F1和FA均表現出優異的清除2, 3-BD的能力。

2.4 F1對模擬體系中AGEs生成的影響

以FA為對照，研究F1對美拉德反應AGEs生成的影響，結果見表2。

表2 F1和FA對AGEs生成的影響 Table 2 Effects of F1 and FA on the formation of AGEs

由表2可知，F1和FA對模擬體系中生成的AGEs表現出抑制作用，并且其抑制作用隨著質量濃度的升高而增強。當質量濃度為50 mg/mL時，F1和FA對AGEs的抑制率分別為97.50%和94.76%。當質量濃度達到30 mg/mL以上時，FA的質量濃度對抑制AGEs生成沒有顯著影響(P>0.05)。F1和FA能很好地抑制美拉德反應過程中的α-二羰基化合物，而作為AGEs的反應底物，α-二羰基化合物的減少能有效抑制AGEs的生成，因此,F1和FA均表現出優異的抑制AGEs的能力。

3 結論

本研究采用凝膠層析技術制備得到高聚合度麥麩FOs組分F1，并對其組成特征進行了分析，得到平均分子質量為(1 671.17±27.40)Da，結合聚合度計算可知其分子組成可能為阿魏?；⒗揪盘?。構建食品美拉德模擬體系，研究F1對美拉德反應中間產物及終產物的影響。結果表明：F1和FA均能夠很好地抑制GO、MGO和2, 3-BD 3種中間產物的產生，并且其抑制作用呈濃度依賴關系?？傮w來說，F1和FA對3種主要α-二羰基化合物抑制效果順序為2, 3-BD>GO>MGO。此外，F1和FA均對終產物AGEs表現出很好的抑制作用，由于F1能有效抑制美拉德反應的中間產物α-二羰基化合物的產生，從而能夠抑制AGEs的生成。