Lactobacillus plantarum M616生長及代謝特性研究

程 強(qiáng)，陳 迪，王金水

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

傳統(tǒng)酸面團(tuán)在我國有悠久歷史，又稱酵子、面肥、酵頭等，其體系復(fù)雜，包含乳酸菌、醋酸菌、酵母菌等多種微生物[1]。在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，多菌種相互作用，協(xié)同發(fā)酵，產(chǎn)生豐富的營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)[2]。相對于單一的酵母發(fā)酵，酸面團(tuán)具有以下優(yōu)勢：酸面團(tuán)在發(fā)酵過程中乳酸菌會產(chǎn)生乳酸、甲酸、乙酸等有機(jī)酸，能有效降低酸面團(tuán)體系的pH值，同時(shí)，低pH值環(huán)境能激活面團(tuán)內(nèi)源蛋白酶，促進(jìn)面團(tuán)面筋蛋白的降解，提高面團(tuán)延展性[3]；乳酸菌在發(fā)酵過程中利用酸面團(tuán)中的麥芽糖產(chǎn)生胞外多糖，提高面團(tuán)的營養(yǎng)價(jià)值，并改善面團(tuán)結(jié)構(gòu)[4]；在酸面團(tuán)體系中，乳酸菌與酵母菌相互作用，發(fā)酵產(chǎn)生酸類、醇類、醛類、芳香族化合物等風(fēng)味物質(zhì)，形成了面團(tuán)體系的風(fēng)味豐富性[5]；在酸面團(tuán)發(fā)酵過程中，乳酸菌會產(chǎn)生細(xì)菌素、乙醇、過氧化氫等抑菌物質(zhì)，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌具有一定的抑制作用，有利于延長酸面團(tuán)產(chǎn)品的保質(zhì)期[6]。

在酸面團(tuán)體系眾多的微生物中，植物乳桿菌作為體系中的優(yōu)勢種群之一，對酸面團(tuán)的品質(zhì)有著重要貢獻(xiàn)[7]。植物乳桿菌M616為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株，作者對其生長及代謝特性展開分析，主要研究了植物乳桿菌M616的生長特性、產(chǎn)酸能力，耐酸、耐鹽、耐膽鹽的能力，以及對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等致病菌的抑制能力，為其在酸面團(tuán)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：植物乳桿菌M616、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌,均為河南工業(yè)大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.005 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.7，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶內(nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用[8]。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入營養(yǎng)瓊脂15 g/L，調(diào)節(jié)pH 6.2～6.7，將培養(yǎng)基分裝滅菌。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g, 用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.6，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶內(nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用， 固體培養(yǎng)基另補(bǔ)加瓊脂粉15.0 g。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，氯化鈉 5.0 g，牛肉膏粉 3.0 g，瓊脂 15.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，煮沸，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.3，將培養(yǎng)基分裝入錐形瓶內(nèi)115 ℃滅菌后，冷卻備用。

1.2 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺：蘇州開泰實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司；Forma 88000 超低溫冰箱：美國Thermo 公司；恒溫培養(yǎng)搖床：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平、實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：美國Pekin Elme公司；紫外-可見光分光光度計(jì)：廣州步步宏科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)：鄭州金友寧有限公司；QUANTA FEG 250 掃描電鏡：美國FEI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

在超凈工作臺上無菌操作。將植物乳桿菌M616菌種接種至滅菌后的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置搖床中37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，活化。取1 mL活化好的菌液到已滅過菌的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，再次放于搖床中37 ℃下培養(yǎng)8 h，使菌株OD600 nm值達(dá)到0.5左右，菌液備用。

1.3.2 菌種形態(tài)觀察

取已經(jīng)活化好的菌液用無菌水依次稀釋10-1～10-5，然后取1 mL接種至裝有MRS固體培養(yǎng)基的平板中，用玻璃涂布棒輕輕涂抹均勻。將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，用接種環(huán)刮取少量菌，進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察。

2.5%戊二醛配制：將0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)50 mL與25%戊二醛水溶液10 mL混合，用蒸餾水定容至1 000 mL。固定：挑取固體培養(yǎng)基表面菌體少許，加入到含有2.5%戊二醛固定液的離心管中，振蕩至分散均勻，固定2～4 h，然后3 000 r/min離心15 min，去除上清液。漂洗：在離心管中加入PBS緩沖液清洗3次，再用超純水清洗2次，每步均在3 000 r/min下離心15 min，去除上清液。脫水：在離心管中依次加入30%、50%、70%、90%乙醇脫水15 min，離心后用乙醇、叔丁醇各自置換10 min，每一步驟后均需離心棄去上清液，最后制成叔丁醇菌懸液。取叔丁醇菌懸液1 mL滴加在錫箔紙上，-20 ℃預(yù)凍后放入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。干燥完成后噴金并進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3.3 生長曲線的測定

在超凈工作臺上，取活化后的菌懸液1 mL至滅過菌的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放至37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔3 h取樣，以沒有加入活化菌株的液體培養(yǎng)基作為對照，在600 nm處測定其光密度OD600 nm。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的光密度為縱坐標(biāo)繪制菌株的生長曲線。

1.3.4 產(chǎn)酸性能測定

在超凈工作臺上，取活化后的菌液2 mL至100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放至37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取出菌液，用pH計(jì)測量菌液的pH值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的pH值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的產(chǎn)酸特性曲線。

1.3.5 耐酸性能測定

在超凈工作臺上，分別取活化過的菌液1 mL至用鹽酸分別調(diào)至pH值為2.0、3.0、4.0 的100 mL MRS培養(yǎng)基中。37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取出菌液，取至第6小時(shí)。以未添加鹽酸的菌懸液培養(yǎng)基為對照，在600 nm處測定菌液的光密度。

1.3.6 耐鹽性能測定

在超凈工作臺上，分別取活化后的菌液1 mL至NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，放置于搖床中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，以沒有加入NaCl的液體培養(yǎng)基作為對照，24 h后測定600 nm下的發(fā)酵液光密度。

1.3.7 耐膽鹽性能測定

在超凈工作臺上，分別取活化后的菌液1 mL至分別加有0.03、0.1、0.2、0.3 g牛膽鹽滅過菌的100 mL MRS培養(yǎng)基中，放置在搖床中37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔1 h取出菌液，取至第4小時(shí),在600 nm處測定菌液的光密度。

1.3.8 抑菌性測定

1.3.8.1 指示菌的活化

在超凈工作臺內(nèi)，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌3種致病菌分別接種至滅過菌的100 mL LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)16～20 h。

1.3.8.2 雙層平皿的制備

取滅菌過的培養(yǎng)皿，分別對平皿傾注固體LB培養(yǎng)基20 mL，在平皿內(nèi)均勻攤鋪，水平放置使冷卻凝固作為底層備用。然后另取滅過菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至48～50 ℃，每100 mL加入40 μL活化好的致病菌菌懸液，混勻后取5 mL倒入凝固的底層培養(yǎng)基上，并使其均勻分開，作為培養(yǎng)基的第2層。最后，取滅過菌的牛津杯4個(gè)，保持間隔距離相同，放置平板中，使其自然沉降，待第2層凝固，備用。

1.3.8.3 植物乳桿菌M616抑菌實(shí)驗(yàn)

取活化好的乳酸菌發(fā)酵液，6 000 r/min離心15 min，把上清液梯度稀釋，分別為1×稀釋、5×稀釋、10×稀釋，在每個(gè)雙層平皿中的牛津杯中分別用移液槍滴裝200 μL稀釋液，封口，放入冰箱4 ℃靜置3 min，取出放入生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)16～20 h，測量各個(gè)抑菌圈直徑。牛津杯外徑為8 mm，抑菌圈C=8 mm為無抑菌活性，8 mm15 mm為高度抑菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌M616形態(tài)觀察

植物乳桿菌M616的形態(tài)觀察結(jié)果如圖1所示。從圖1a可以看出，乳酸菌在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h后，MRS固體平板上長出許多乳白色光滑的菌落，呈圓形，表面凸起，濕潤易挑起。從圖1b可以看出，經(jīng)過革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到植物乳桿M616呈紫色，由此可判斷植物乳桿菌M616是革蘭氏陽性菌。用掃描電鏡觀察植物乳桿菌M616的形態(tài)如圖1c所示，該菌呈直或彎的短桿狀，菌體大小約為2.0 μm×0.4 μm，無芽孢，無鞭毛，單個(gè)或成對、成鏈狀排列。

圖1 植物乳桿菌M616的形態(tài)觀察結(jié)果Fig.1 Morphology of Lactobacillus plantarum M616

2.2 植物乳桿菌M616的生長曲線和產(chǎn)酸曲線

植物乳桿菌M616生長曲線如圖2所示，在0～3 h內(nèi)菌體增長緩慢，處于生長延遲期；4 h后，菌株快速增殖，進(jìn)入對數(shù)生長期；在20 h后曲線趨于平緩，此階段活菌數(shù)變化不大，生長與死亡菌體數(shù)量達(dá)到平衡。

圖2 植物乳桿菌M616的生長曲線Fig.2 Growth curve of Lactobacillus plantarum M616

產(chǎn)酸曲線如圖3所示，植物乳桿菌M616可在較短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)酸，使菌液pH值迅速下降。在前15 h，pH值由初始6.07下降至4.48，經(jīng)過30 h后下降到了3.89，顯示了菌株良好的產(chǎn)酸能力。pH值判斷法是評價(jià)乳酸桿菌的產(chǎn)酸性能方法之一[9]。張艷萍等[10]在篩選乳酸菌抑菌作用的研究中，從88株乳酸菌中篩選出29株產(chǎn)酸能力較好的菌株，其pH值在4.50～4.65之間。

圖3 植物乳桿菌M616的產(chǎn)酸能力Fig.3 Acid production ability of Lactobacillus plantarum M616

與之相比，植物乳桿菌M616生長迅速，培養(yǎng)4 h即可進(jìn)入快速生長期，同時(shí)菌株還具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，在進(jìn)入穩(wěn)定期后，產(chǎn)酸仍在繼續(xù)。由此可見，植物乳桿菌M616具有良好的生長活性，可初步判斷該菌株具有潛在的發(fā)酵性能。

2.3 植物乳桿菌M616耐酸性能

植物乳桿菌M616在pH值為2.0、3.0、4.0時(shí)的生長情況如圖4所示。

圖4 不同pH值對植物乳桿菌M616生長的影響Fig.4 Effects of different pH values on the growth of Lactobacillus plantarum M616

圖4表明，不同的pH值對菌體生長影響不同，植物乳桿菌M616在接種初期的6 h內(nèi)，隨著pH值升高，生長速率呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，pH 4.0時(shí)菌株生長最快。在pH 2.0和pH 3.0的液體培養(yǎng)基中，菌株生長緩慢。在3 h后植物乳桿菌在pH 3.0的環(huán)境下較pH 2.0生長速率快，表明低pH值對菌株生長有抑制作用。在pH 4.0條件下，菌株在2 h之后逐漸適應(yīng)了酸性環(huán)境，生長速率快速增長，OD600 nm由2 h的0.05快速增長至6 h的0.25，而在pH 2.0、3.0條件下，變化不明顯。

2.4 植物乳桿菌M616耐鹽性能

植物乳桿菌M616在NaCl不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的生長情況如圖5所示。

圖5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl對植物乳桿菌M616生長的影響Fig.5 Effects of different mass fractions of NaCl on the growth of Lactobacillus plantarum M616

由圖5可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，菌體的生長速率持續(xù)降低。在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于4%時(shí)其生長速率下降緩慢，抑制作用較弱；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%～8%時(shí)生長速率快速下降，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%時(shí)菌株生長緩慢，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，菌體生長抑制效應(yīng)愈明顯，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到8%以上時(shí)菌株幾乎不能生長。由此可見，菌株生長速率和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，環(huán)境中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，菌體生長越受抑制。對比湯偉等[11]分離的消化乳桿菌W639 菌株的耐鹽試驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%條件下仍然可以生長，可判斷出M616的耐鹽性能一般。植物乳桿菌在泡菜以及肉制品中發(fā)酵的條件是在不低于5%的鹽水條件下仍然可以正常存活。由此可見，植物乳桿菌M616具有一定的耐鹽性，可適用于食品發(fā)酵和工業(yè)生產(chǎn)。

2.5 植物乳桿菌M616耐膽鹽性能

研究了植物乳桿菌M616在4種不同膽鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，其生長的變化情況如圖6所示。

圖6 不同質(zhì)量濃度的牛膽鹽對植物乳桿菌M616生長的影響Fig.6 Effects of different mass concentrations of bile salt on the growth of Lactobacillus plantarum M616

圖6顯示，在膽鹽質(zhì)量濃度為0.03 g/100 mL的條件下，植物乳桿菌M616的生長受抑制較小，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，其光密度呈快速增長趨勢，說明在0.03 g/100 mL的低膽鹽質(zhì)量濃度環(huán)境中菌株的生長幾乎不受影響。菌株在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.3 g/100 mL條件下，其生長速率均緩慢地上升，其中在0.3 g/100 mL的條件下生長最慢。4 h時(shí)，菌株在0.3 g/100 mL條件下的生長速率略微降低。對比蒙月月等[12]的植物乳桿菌KLDS1.0318的耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果，植物乳桿菌M616在膽鹽質(zhì)量濃度分別為0.03、0.1、0.2 g/100 mL時(shí)的生長速率均超過KLDS1.0318，表明植物乳桿菌M616具有良好的耐膽鹽能力。

2.6 植物乳桿菌M616的抑菌性

對植物乳酸桿菌M616發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌性測試，選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌作為測試菌，結(jié)果如圖7、圖8 所示。

圖8 植物乳桿菌M616的抑菌圈直徑Fig.8 Diameter of inhibition zone of Lactobacillus plantarum M616

圖7顯示，植物乳桿菌M616發(fā)酵液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌均有一定的抑制作用。發(fā)酵液10倍稀釋，仍對3種測試菌表現(xiàn)出抑菌效果，隨著發(fā)酵液稀釋倍數(shù)的降低，抑菌圈直徑逐漸變大。從圖8可看出，對大腸桿菌的抑菌直徑由10倍稀釋的10 mm增加到14 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑由10倍稀釋的11 mm增加到15 mm，其中對單增李斯特菌的抑菌效果最為明顯，由最小的11 mm增加到最大的17 mm，增加了54.5%。陸春波等[13]通過對植物乳桿菌DY6發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)做初步分離研究，發(fā)現(xiàn)主要抑菌物質(zhì)為小分子有機(jī)酸和脂肪酸。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種抑菌成分，如有機(jī)酸(乳酸、甲酸、乙酸等)、乙醇、細(xì)菌素等[14]。有機(jī)酸對有害菌的抑制機(jī)制最常見有兩種：一是有機(jī)酸通過與細(xì)菌細(xì)胞膜上脂多糖等成分結(jié)合，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，降低了細(xì)胞的活性，從而達(dá)到抑菌效果；二是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸降低了細(xì)菌胞內(nèi)的pH值，影響了細(xì)菌的代謝活動，從而達(dá)到抑制作用[15]。

3 結(jié)論

以植物乳桿菌M616作為研究對象，對其基本形態(tài)、生長曲線、產(chǎn)酸能力、耐酸、耐鹽、耐膽鹽及抑菌能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：植物乳桿菌M616為革蘭氏陽性菌，菌株呈直或彎曲的桿狀，無芽孢；植物乳桿菌M616生長較快，培養(yǎng)4 h后，開始進(jìn)入了對數(shù)生長期；植物乳桿菌M616在37 ℃ MRS搖瓶中發(fā)酵30 h,pH值達(dá)3.89；該菌株能耐受pH 3.0的酸度和8%的NaCl及0.2%的牛膽鹽；植物乳桿菌M616的發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及單增李斯特菌具有抑制作用，其中對單增李斯特菌的抑制效果最好。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可為此菌株在酸面團(tuán)發(fā)酵中的應(yīng)用奠定一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。