果膠季銨鹽衍生物的合成、表征及抗菌活性

雷萬學

河南財政金融學院 化學與環境學院，河南 鄭州 450046

果膠(pectin) 是一類易溶于水的酸性天然多糖類的高分子化合物，在高等植物的細胞壁中含量豐富，其主要成分為具有較高聚合度的D-半乳糖醛酸，分子內各單元之間通過α-1，4糖苷鍵相連，分子中的部分羧基被甲酯化[1]。市場上銷售的果膠通常是以農產品廢棄物如蘋果皮、橘子皮、柚子皮、葵花盤等為原料提取得到，在食品、制藥、醫療、生物工程和環境保護等行業中廣泛應用，一般用作乳化劑[2]、穩定劑[3]、膠凝劑[4]、增稠劑[5]、解毒劑[6]、藥物載體和吸附劑等[7-8]。果膠分子上帶有較多的羥基與羧基，有利于進行物化改性及化學修飾，從而改善其理化性質與功能[9-12]。而研究果膠與季銨鹽的交聯反應，給果膠分子表面固載抗菌基團，有望用于食品包裝和醫用敷料，為擴大果膠的應用范圍開辟新的途徑。作者研究了果膠與二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨的交聯反應,得到果膠季銨鹽衍生物(P-OSA)，并對其進行了抗菌性能測定。

1 材料與方法

1.1 測試儀器

傅里葉變換紅外光譜儀：美國 Nicolet公司；AvanceⅢ400 MHz核磁共振波譜儀：瑞士 Bruker公司；納米粒度和Zeta電位儀：英國 Malvern儀器有限公司；掃描電子顯微鏡：美國 FEI公司。

1.2 試劑與材料

二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(OSA)：美國AEGIS公司；果膠：自制；卵磷脂、吐溫-80等試劑均為分析純。

1.3 菌種與培養基

抗菌實驗中所用的3種菌種均為具有代表性的致病菌：第1種是革蘭氏陰性菌的代表，大腸桿菌Escherichiacoli(8099)；第2種是革蘭氏陽性菌的代表，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC6538)；第3種為真菌的代表，白色念珠菌Candidaalbicans(ATCC10231)。沙堡氏液體培養基、營養肉湯培養基、沙堡氏瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、營養瓊脂培養基均為青島海博生物技術有限公司生產。

1.4 果膠季銨鹽衍生物的制備

1.4.1 果膠的制備

稱取500 g去蒂的新鮮柑橘皮，水洗晾干，壓榨出橘油。將固體用95%乙醇浸沒1 h，過濾，壓榨濾餅。如此反復3次，濾液合并后用于提取色素及回收乙醇，橘渣用水漂洗3次后壓榨脫醇。稱取200 g脫醇后的橘渣，加1.8 L水，用鹽酸調pH值為1.8，水浴加熱至95 ℃水解1 h，壓濾，濾渣用熱水洗滌2次。濾液濃縮后快速冷卻，用等體積的乙醇沉淀，壓濾，濾餅用乙醇充分洗滌3次后，80 ℃真空干燥，粉碎，過100目篩，得到類白色果膠粉[13]。

1.4.2 果膠季銨鹽衍生物的制備

稱量2.00 g自制的果膠粉6份，分別用質量分數為5%、10%、15%、20%、25%、30%OSA的乙醇水溶液在室溫浸沒8 h，過濾，80 ℃真空干燥，置于索氏萃取器中用乙醇于80 ℃萃取24 h，以除去未反應的OSA(或以其他分子間的作用力吸附在果膠上的OSA)，干燥，粉碎，過100目篩，得到果膠季銨鹽衍生物(P-OSA)。用微量凱氏定氮儀測定P-OSA的含氮量，計算固載率Y。

式中：N表示P-OSA中氮的質量分數；451.18為OSA的分子量；14.01為氮的原子量。

OSA與果膠反應制備果膠季銨鹽衍生物的化學反應分為兩步，其化學反應方程式分別見圖1和圖2。

圖1為OSA與果膠反應制備果膠季銨鹽衍生物的化學反應的第1步。OSA在常溫(或加熱)條件下與水發生水解反應，OSA分子中的3個硅甲氧基水解形成相應的硅羥基，主要產物為二甲基十八烷基[3-(三羥基硅基)丙基]氯化銨，副產物為甲醇。

圖1 OSA的水解反應Fig.1 Hydrolysis reaction of OSA

圖2為OSA與果膠反應制備果膠季銨鹽衍生物的化學反應的第2步。在加熱的條件下，二甲基十八烷基[3-(三羥基硅基)丙基]氯化銨分子中的硅羥基與果膠分子中的碳羥基發生分子間的縮水反應，生成果膠季銨鹽衍生物。

圖2 水解后的OSA與果膠的反應Fig.2 Reaction between hydrolyzed OSA and pectin

1.5 測試和表征

采用FTIR 紅外光譜儀、AvanceⅢ400 MHz核磁共振波譜儀和 Zeta電位分析儀分別對產物進行紅外、1H NMR和Zeta電位測試。并采用掃描電子顯微鏡觀察產物的形貌結構。

1.6 抗菌實驗

在3個250 mL 無菌錐形瓶中分別加入0.5 g 所制備的P-OSA(Y=15.64%)及90 mL無菌水，再各加入10 mL濃度為108cfu·mL-1的菌懸液，置入20 ℃恒溫水浴振蕩器中，控制轉速200 r/min，時間分別為5、15、30 min時，在相應的錐形瓶中分別加入中和劑，再繼續振蕩作用10 min，分別將作用后的菌懸液各取0.5 mL，用10倍的梯度進行稀釋后，進行活菌計數實驗，培養溫度為37 ℃，培養時間為48 h，計算原菌液的含菌數與實驗樣品溶液的存活菌數以及殺菌率[14]。

2 結果與討論

2.1 果膠和P-OSA紅外光譜分析

在常溫下，果膠和P-OSA的紅外光譜如圖3所示。

圖3 果膠(a)和P-OSA(b)的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of pectin(a) and P-OSA(b)

2.2 果膠、OSA和P-OSA的1H NMR分析

果膠、OSA和P-OSA的1H NMR如圖4所示。

圖4 OSA(a)、果膠(b)和P-OSA(c)的1H NMRFig.4 1H NMR spectra of OSA(a), pectin(b) and P-OSA(c)

由圖4可知，在P-OSA的波譜中，除了出現果膠上的質子共振峰外，還出現了OSA側鏈上的質子共振峰，在δ0.88～0.91處出現了甲基(N+—C1～C17—CH3)的質子共振峰，在δ1.29～1.39處出現了亞甲基[N+—C—C—(CH2)15—C]的質子共振峰，在δ1.80～1.90處出現了亞甲基(N+—C—CH2—C—)的質子共振峰，在δ3.11處出現了與氮相連接的甲基(N+—CH3)的質子共振峰等，而且，在P-OSA波譜中OSA分子中的硅甲氧基的質子共振峰(δ2.87，Si—O—CH3)已經消失，這表明OSA已經固載到果膠上，得到了目標產物P-OSA。

2.3 Zeta電位分析

溶液pH值對果膠和P-OSA的Zeta電位的影響見圖5。從圖5可以看出，果膠的零電位pH值較低，pH≈3.4，當溶液的pH <3.4 時，果膠的表面帶正電荷；當溶液的pH >3.4時，果膠的表面帶負電荷，而且，隨著溶液pH值的增加，果膠Zeta電位的絕對值也相應增大。從圖5同樣可以發現，果膠季銨鹽衍生物P-OSA的零電位pH值較高，pH≈8.2，而且其表面所帶電荷隨溶液pH值的改變而變化的規律與果膠的情況類似。

由圖5可以看出，由于果膠的零電位在pH 3.4附近，在水溶液中帶負電荷，而且隨pH值的增大其負電荷增加。而P-OSA的零電位在pH 8.2附近，在水溶液中帶正電荷，這是由于P-OSA的表面固載了季銨鹽陽離子。

圖5 果膠和P-OSA的Zeta電位Fig.5 Zeta potential of pectin and P-OSA

2.4 SEM結果與分析

果膠與P-OSA的SEM照片如圖6所示。

圖6 果膠和P-OSA的SEM照片Fig.6 SEM characterization of pectin and P-OSA

從圖6可以看出，果膠與P-OSA兩個樣品中都存在較多的微孔，P-OSA的微孔大小及分布與果膠的相比沒有顯著差別，這說明在季銨鹽和果膠進行化學反應形成果膠季銨鹽衍生物P-OSA的反應過程中，沒有對果膠的外觀、形貌等方面產生顯著影響。

2.5 抗菌效果

通過懸菌定量實驗可以發現，果膠季銨鹽衍生物P-OSA分別和白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌接觸不同的時間，其殺菌效果亦不相同，具體情況見表1。

表1 P-OSA與實驗菌接觸不同時間的殺菌率Table 1 Bactericidal rate of P-OSA in contact with experimental microorganisms at different time

通過表1可以發現：所制備的樣品P-OSA的抗菌效果與作用時間呈正相關。隨著P-OSA分別與3種實驗微生物作用時間的延長，其殺菌率也隨之相應提高，當作用時間為30 min時，P-OSA對3種實驗微生物的殺菌率均達到了99.99%。其中，當接觸時間≤15 min時，P-OSA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效果較好，而對白色念珠菌的抗菌效果稍差。這是由于P-OSA中帶正電荷的季銨基團容易與帶負電荷的細菌細胞膜結合，并對其進行干擾破壞，使胞內物質泄漏導致菌體死亡[15]。

3 結論

二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨通過化學鍵可以固載到果膠表面，制備果膠季銨鹽衍生物；果膠的零電位pH≈3.4，所制備的果膠季銨鹽衍生物的零電位pH≈8.2，季銨基團的引入導致其零電位顯著提高；抗菌實驗結果表明，所制備的果膠季銨鹽衍生物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌均有良好的殺菌作用，接觸15 min的殺菌率分別為99.97%、99.99%和98.96%，接觸30 min的殺菌率均為99.99%。