Urolithin A在肺癌細胞系A549中的抗增殖效應

程 峰,竇晉濤,2，張 庸,3,王 祥,4，吳志浩,5

(皖南醫學院 1.腫瘤微環境研究室;2.麻醉學院;3.臨床醫學院;4.檢驗學院;5.基礎醫學院，安徽 蕪湖 241002)

據統計，肺癌發病率居所有癌癥之首，是預后極差的惡性腫瘤，5年生存率僅為19%[1]。盡管化療以及近年來興起的腫瘤免疫治療對肺癌顯示很好的作用[2]，然而肺癌細胞仍然表現出耐藥現象[3-4]，給肺癌的診療帶來了一定的困難。因此尋找其他的靶點以及開發新的藥物變得尤為重要。

近年來大量研究發現腸道菌群生態與人體健康密切相關[5]。尿石素A(Urolithin A)是一種腸道代謝產物。石榴中含有大量的多酚類鞣酸，食用后經腸道微生物分解后形成活性產物Urolithin A[6]。Urolithin A具有抗氧化[7]、肌肉重塑[6]、抗炎癥[8]的作用。本研究旨在探究Urolithin A對肺癌細胞的殺傷作用，為臨床用藥提供指導。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 人肺癌細胞系A549(中科院細胞庫)，Urolithin A(SIGMA)，MTT(Beyotime)，SA-β-gal試劑盒(Beyotime)，膜和胞漿蛋白提取試劑盒(Beyotime)，Laemmli 2×濃縮液(SIGMA)，Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD公司);p53抗體，p21抗體，Cleaved PARP抗體，PUMA抗體購自CST公司。p53 shRNA(addgene)。酶標儀(BioTek)，垂直電泳儀(Biorad),凝膠成像儀(GE,AI600)，硝化纖維素(NC)膜(GE Healthcare)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 培養條件：10%FBS的DMEM培養基，37℃，5%的CO2的培養箱，細胞均用胰酶消化傳代，實驗處理期均為對數生長期。

1.2.2 MTT實驗 待A549細胞生長至對數期，消化離心，將其接種到96孔板中，放在37℃，5%的CO2培養箱中培養。細胞長滿后，實驗設置對照組、不同劑量組，每組設4個復孔。對照組、不同劑量組的Urolithin A濃度分別為0、2.5、5、10、30、50 μmol/L。48 h后用稀釋后的MTT溶液處理，放置于37℃，5%的CO2培養箱孵育4 h。將96孔板拿出，在超凈臺里每孔加入150 μL的DMSO溶液。常溫下，避光，在搖床上孵育15 min。用酶標儀在490波長處測每個孔的OD值。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 待六孔板中細胞長至90%時，用無血清的DMEM培養基饑餓A549細胞過夜。加入不同濃度(10、20 μmol/L)的Urolithin A處理細胞24 h。無EDTA的胰酶溶液消化，用PBS懸浮細胞離心，收集約1×105細胞。500 μL的Binding Buffer懸浮細胞后，加入5 μL的Annexin V-FITC，吹打后再加入5 μL的PI染料混勻。常溫避光15 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 SA-β-gal實驗檢測細胞衰老 加入不同濃度(5、20 μmol/L)的Urolithin A處理六孔板中的細胞。24 h后，用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測。用酶標儀檢測細胞衰老程度。

1.2.5 Western blot實驗 用樣品緩沖液Laemmli 2×濃縮液對細胞進行刮除并收集，用膜和胞漿蛋白提取試劑盒分離總蛋白或膜蛋白濃度。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每個樣品的蛋白質，然后轉移到硝化纖維素(NC)膜并用抗體孵育。這些信號被曝光機曝光成影，用PS軟件截圖分析。

2 結果

2.1 Urolithin A對A549細胞增殖的影響 與對照組相比，2.5、5、10、30、50 μmol/L的Urolithin A處理A549細胞24 h后，細胞活力均下降(P<0.05)。見圖1。

F=88.95，P=0.000；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 Urolithin A對A549細胞凋亡的影響 與對照組相比，10、20 μmol/L的Urolithin A處理24 h后,A549細胞凋亡數均增加(P<0.05)。見圖2。

F=29.97，P=0.001；與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 Urolithin A對A549細胞衰老的影響 10、20 μmol/L的Urolithin A處理24 h后，被SA-β-gal染色的衰老細胞數均增加(P<0.05)。見圖3。

F=142.20，P=0.000；與對照組相比，**P<0.01。

2.4 Urolithin A處理A549細胞對細胞衰老和凋亡相關蛋白的影響 2.5、5、10、30、50 μmol/L的Urolithin A處理肺癌A549細胞12 h后,與對照組相比，Cleaved PARP、p21、PUMA、p53蛋白表達均升高(P<0.05)，見圖4A。用shRNA敲降p53,相同濃度Urolithin A處理后，Cleaved PARP、p21、PUMA的表達均下調(P<0.05)，見圖4B。

A.F=57.30，P=0.000；F=28.92，P=0.000；F=20.30，P=0.000；F=44.00，P=0.000；與Urolithin A(0 μmol/L)相比，*P<0.05，**P<0.01；B.t1=4.086，t2=5.824，t3=3.326，t4=11.910，P1=0.015，P2=0.028，P3=0.029，P4=0.000；t1=9.216，t2=7.140，t3=4.501，t4=11.800，P1=0.001，P2=0.019，P3=0.011，P4=0.000；t1=7.547，t2=3.391，t3=4.096，t4=14.460，P1=0.002，P2=0.028，P3=0.015，P4=0.000；相同濃度Urolithin A，敲降p53與未敲降相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.5 Urolithin A通過p53抑制A549細胞的增殖 MTT實驗結果顯示，shRNA敲低p53能減弱Urolithin A對A549細胞引起的增殖抑制(P<0.05)(圖5A)。同時，用不同濃度的Urolithin A處理肺癌細胞H1299(p53缺失型)，低濃度組(2.5、5 μmol/L)對細胞增殖無影響(P>0.05)，高濃度組(10、30、50 μmol/L)對H1299細胞有輕微抑制作用(P<0.05)(圖5B)。

A.F=82.19，P=0.000；Urolithin A(10 μmol/L)+shp53組與單用Urolithin A(10 μmol/L)組相比，**P<0.01；B.F=48.33，P=0.000；與Urolithin A(0 μmol/L)相比，**P<0.01。

3 討論

近年來，肺癌的治療手段呈現多樣化發展，尤其比較盛行的PD1/PD-L1療法，對晚期肺癌的生存率有很大的延長效應，但是總體存活率低，預后不良依然嚴重。因此尋找新藥和靶標顯得尤為重要。

本研究發現，Urolithin A能夠抑制A549細胞的增殖，進一步通過流式細胞術和SA-β-gal實驗證明了Urolithin A能夠促進A549細胞凋亡和衰老。然而Urolithin A究竟通過什么信號傳導通路促進A549細胞凋亡和衰老，具體的分子機制還不是很清楚，值得我們深入探討。

細胞凋亡是比較常見的細胞程序性死亡方式，受基因調控。PARP是一種DNA修復酶，參與DNA修復工作。一般來說，PARP蛋白被Caspase蛋白切割成Cleaved PARP是細胞發生凋亡的標志[9]。通過Western blot實驗發現Urolithin A能夠上調Cleaved PARP的水平，進一步證明Urolithin A處理A549細胞，促使其發生凋亡。在50%的癌癥中，最常見的突變之一是腫瘤抑制基因TP53，包括其功能的喪失或獲得[10]。由于其抑癌活性，轉錄因子p53被認為是基因組的守護者或看護者。p53可調控細胞周期阻滯[11]、凋亡[12]和DNA修復相關基因的表達[13]。PUMA是p53的直接轉錄靶標，它能誘導大部分癌癥細胞的凋亡。PUMA是Bcl-2家族的成員之一，具有一個“BH3-only”結構域。PUMA位于線粒體中，并觸發線粒體功能障礙介導的細胞凋亡。它通過Bax/Bak對抗BCL-XL和MCL-1的功能[14]。細胞衰老也是由基因控制的一種生物學現象，相應的，細胞衰老的分子機制有很多種。p53-p21是比較經典的細胞衰老調控通路[15]，p53的主要靶基因是p21，將導細胞周期阻滯在G1/S期。因此我們猜想Urolithin A是否通過p53介導了A549細胞的凋亡和衰老？

肺癌細胞系A549遺傳背景為野生型p53，而本研究發現Uroltihin A能夠上調p53蛋白的表達，且有濃度依賴性。再次通過Western blot實驗顯示，Urolithin A也能使轉錄因子p53下游基因p21、PUMA的表達上調。原因可能為Urolithin A通過p53介導了下游p21、PUMA的表達。用p53的shRNA沉默抑癌基因p53，再用Urolithin A處理，下游基因p21、PUMA明顯下調。MTT實驗結果顯示，shRNA敲低p53能減弱Urolithin A對A549細胞引起的增殖抑制，同時Urolithin A對p53缺失型肺癌細胞H1299不敏感，這更一步證明了，p53介導了p21和PUMA的上調,且p53是Urolithin A引起A549細胞發生凋亡和衰老的關鍵因子。

雖然本研究結果證明了Urolithin A能夠抑制A549細胞增殖，并且從細胞凋亡和細胞衰老兩方面進行了研究，但是仍有部分分子機制沒有探究清楚。①Urolithin A如何上調p53蛋白的表達,直接還是間接？②還需要構建p53、p21、PUMA等基因表達載體，來使Urolithin A-p53-p21/PUMA通路的研究更加有說服力。同時，通過裸鼠成瘤實驗在活體水平上來檢測是否有意義也有待于進一步驗證。