基于線粒體COI基因5′端區段粉螨DNA條形碼研究

張蘭香，詹雨娟，李夢珠，王 嚴，李心玫，褚凌渺，孫恩濤

(皖南醫學院 衛生檢驗與檢疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

粉螨隸屬于蜱螨亞綱(Acari)、真螨總目(Acariformes)、無氣門亞目(Astigmata)。粉螨種類繁多,是重要的致敏原,可導致螨性過敏性疾病[1]。不同粉螨所含致敏原不同,因此,粉螨的準確鑒定可為臨床藥物和免疫治療提供基礎資料[2]。螨類鑒定主要依據成螨形態,然而粉螨個體微小、生境復雜等現象難以實現快速準確的形態學鑒定[3]。

自2003年Hebert等[4]提出DNA條形碼概念,DNA條形碼廣泛應用于物種鑒定[5-6]。目前,常用于螨類鑒定的分子標記主要包括線粒體基因和核基因[5-7]。線粒體COI基因具有較快的進化速率、明顯的種間差異、較低的種內變異等特性,因而常用于探討近緣種、地理種群等低級階元的鑒定[7-9]。Webster等[8]基于377 bpCOI基因中央區段鑒定粗腳粉螨(Acarussiro)及其近緣種小粗腳粉螨(A.farris)和靜粉螨(A.immobilis)；吳太葆[9]基于該中央區段研究不同地理種群的橢圓食粉螨(Aleuroglyphusovatus)和腐食酪螨(T.putrescentiae),未發現不同地理種群間該中央區段序列存在差異。

研究表明,COI基因不同區段的進化速率差異會影響DNA條形碼的鑒定[6,10]。Yang等[11]應用377bpCOI基因中央區段對粉螨進行物種鑒定,未擴增到熱帶無爪螨(Blomiatropicalis)的目的片段,且不同螨種所需退火溫度差異較大；Khaing等[12]基于該中央區段的系統樹表明建樹結果不符合形態學分類,且部分粉螨的分類置信度較低。因此，僅基于377bpCOI基因中央區段對粉螨進行分類鑒定有一定局限性。

線粒體DNA的661 bpCOI基因5′端區段[13]被廣泛用于癢螨、蠕形螨等螨類的物種鑒定[5-6]。目前尚未報道該基因區段對于粉螨的物種鑒定。因此,本研究探討661 bpCOI基因5′端區段是否適合常見儲藏物粉螨的物種鑒定,為構建粉螨DNA條形碼數據庫提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集、分離和形態鑒定 本研究樣本采集于2019年5～7月安徽省部分地區的儲藏物中(表1)。從樣本中挑取單個成螨，進行純培養。從培養標本中挑取成螨制成玻片標本，依據形態學特征進行鑒定[14]。另取成螨于70%乙醇溶液固定，存放于-20℃，備DNA提取。

1.2 DNA提取、PCR擴增、克隆和測序 參照文獻[15]提取單只螨基因組DNA。擴增引物為COI基因5′端區段[13]：LOC1490 5′-TTTTCTACHAAYCATAAAGATATTGC-3′，HCO2198 5′-TATAAACYTCDGGATGNCCAAAAAA-3′，經PCR擴增、克隆測序后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3 序列分析 所獲序列進行同源性比對。結合GenBank已知12條粉螨COI基因5′端序列，用ClustalX 1.83軟件進行多序列比對，基于MEGA X軟件[16]進行數據分析。以粒形硬蜱(lxodes granulatus)作為外群，構建Maximum Likelihood(ML)系統發育樹。

2 結果

2.1 形態學鑒定 本次采集的粉螨隸屬于5科6屬7種,表中基因序列號均來自本實驗的PCR測序剪切上傳至Genbank，見表1。

表1 粉螨采集信息及基因序列號

2.2 分子鑒定 共獲77條661 bp的粉螨COI基因序列，其中單倍型29條序列，并將序列上傳至GenBank(表1)。所獲序列經Blast比對顯示，表2中5種粉螨分子鑒定結果與形態學結果一致；由于GenBank缺少拱殖嗜渣螨和納氏皺皮螨相關序列，因此未能準確比對結果。

表2 獲得序列在GenBank中Blast比對結果

2.3 堿基組成和變異位點 7種粉螨COI基因單倍型序列29條，結合GenBank已知12條粉螨COI基因序列(表3)。對10種粉螨的COI基因序列堿基組成分析可知，COI片段具有A/T含量偏向性。依據不同地理種群變異位點分析，結果顯示種內變異位點小于種間。10種粉螨共檢測到261個變異位點，400個保守位點，247個簡約信息位點。

表3 GenBank中粉螨COI基因序列

2.4 遺傳距離 依據不同地理種群遺傳距離分析結果見表4。種內遺傳距離小于種間，種間遺傳距離大于種內10倍以上。

表4 10種粉螨的遺傳距離分析

2.5 系統發育樹 基于線粒體COI基因5′端區段，以粒形硬蜱(lxodesgranulatus)作為外群，使用MEGA X軟件構建ML系統發育樹(圖1)。7種不同種屬粉螨均能獨立聚為一支，且支持率均達100%，與形態學分類一致。

*為本研究所獲得的序列。

3 討論

粉螨形態學鑒定容易受到螨體微小、形態不完整及環境變異等限制[3]，DNA分子標記可有效彌補形態學鑒定的不足[8]，常用于粉螨鑒定的線粒體COI基因具有適宜的進化速率，廣泛用于親緣關系較近的粉螨物種鑒定[7-9]。研究表明，基于377 bpCOI基因中央區段[11-12]探究粉螨種屬關系尚存在一定限制。

本研究基于661 bpCOI基因5′端區段進行7種常見儲藏物粉螨的物種鑒定，通過堿基組成分析，均存在A/T偏向性；進行變異位點和遺傳距離分析，同種粉螨不同地理種群間序列差異較小，遺傳距離均小于2%，說明661 bpCOI基因5′端區段不受地理種群影響；種內序列差異小于種間，種間遺傳距離與種內之比大于10倍以上，符合Hebert等[4]提出的物種鑒定有效標準。說明該基因區段能較好地區別種屬關系；同時結合系統發育樹分析，7種不同種屬粉螨均能獨立聚為一支，與形態學鑒定一致。提示該基因5′端區段可用于7種常見儲藏物粉螨的物種鑒定。

本研究首次提交了納氏皺皮螨和拱殖嗜渣螨的661 bpCOI基因5′端區段序列，由于GenBank缺乏其相關序列信息，因此沒有準確的比對結果。表明DNA條形碼進行物種鑒定受數據庫中信息不全的限制，亟待盡可能全地收集不同種類及地理種群的粉螨，完善661 bpCOI基因5′端區段的數據庫，為構建DNA條形碼數據庫提供基礎資料。