HPLC-MS/MS法同時測定參附強心丸中制附子6種生物堿含量

劉言浩，梁大虎，孫 華，吳子靜，張袁祥，李 超，董 健，李紅金，韓誠正，謝海棠

(1.皖南醫學院 研究生學院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院 a.安徽省藥物臨床評價中心；b.中西醫結合門診，安徽 蕪湖 241001)

參附強心丸為中成藥名，由人參、附子(制)、桑白皮、豬苓、葶藶子、大黃組成。具有益氣助陽、強心利水的作用。多用于慢性心力衰竭引起的心悸、氣短、胸悶喘促、面肢浮腫等癥狀的治療，收載于《中國藥典》2015年版一部[1]。制附子作為參附強心丸中一項重要組成部分，具有回陽救逆、強心護心的作用[2-3]。然而其所含的生物堿成分既是藥效物質也存在極大的毒性，過量服用會導致出現如室性心律失常等一系列危及生命的癥狀[4-6]。制附子含有的雙酯型生物堿毒性極強，其中烏頭堿成人致死量為2～5 mg，烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的小鼠靜脈給藥的LD50分別為0.12～0.27、0.1～0.13、0.47 mg/kg。而作為其主要藥效成分的單酯型生物堿也具有一定的毒性[7-10]。烏頭類生物堿引起的中毒事件屢見不鮮，因此對含附子的藥物制劑進行質量控制顯得極為重要[11-14]。因此，建立參附強心丸的主要生物堿含量測定方法，對于確保參附強心丸安全性和有效性很有必要。本實驗采用HPLC-MS/MS技術建立了參附強心丸中6種主要生物堿烏頭堿(AC)、新烏頭堿(MA)、次烏頭堿(HA)、苯甲酰烏頭原堿(BAC)、苯甲酰新烏頭原堿(BMA)、苯甲酰次烏頭原堿(BHA)的含量測定方法，為參附強心丸中制附子的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 API4000質譜儀，Analyst1.6.2質譜數據處理軟件(美國應用生物系統公司)，METTLER TOLEDO ME55微量分析天平(德國賽多利斯公司)；N-1001旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器有限公司)；Thermo-21R高速離心機(賽默飛世爾科技有限公司)。AC(批號19062402，含量98%)、BAC(批號19070506，含量98%)、BMA(批號19062701，含量98%)、BHA(批號19090903，含量98%)購于成都思天德生物科技有限公司；MA(批號19062701，含量98.97%)、HA(批號28867，含量98%)購于MedChemExpress LLC；內標：氫溴酸高烏甲素(LH)(批號Z14N7B24783，含量98%)，購于上海源葉生物科技有限公司；參附強心丸(天津中興藥業集團股份有限公司達仁堂制藥廠，批號5150009、5150012、5150013)。乙酸銨和濃氨水為分析純；乙醚、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、異丙醇、甲醇、甲酸等為色譜純；水為去離子超純水。

1.2 色譜及質譜條件

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動相：70%乙腈-水(含0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨)，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。

1.2.2 質譜條件 采用電噴霧電離源(ESI)，正離子掃描，多反應離子監測模式(MRM)進行定量分析。各成分的質譜參數見表1。

表1 各種成分的質譜分析參數

1.3 溶液的配制

1.3.1 對照品溶液的配制 分別精密稱取AC、MA、HA、BAC、BMA、BHA對照品適量，置量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶解得6.55、1.42、1.65、2.13、3.57、3.19 mg/mL的單一對照品儲備液，精密量取各對照品儲備液適量混合加純甲醇稀釋得6種生物堿的濃度分別為AC 0.655 9 mg/mL；MA 0.142 mg/mL；HA 0.165 mg/mL；BAC 0.213 mg/mL；BMA 0.357 mg/mL；BHA 0.319 mg/mL的混合對照品儲備液，所有溶液均4℃保存。

1.3.2 內標溶液的配制 精密稱取LH對照品適量，以甲醇溶解得濃度為0.128 mg/L的內標儲備液。使用時，以甲醇進一步稀釋得濃度為95 mg/mL的內標溶液，4℃保存。

1.3.3 供試品溶液的配制 取參附強心丸9丸,稱重,計算平均粒重,剪成小塊，混勻，精密稱定0.1 g,置有塞錐形瓶中,加濃氨試液4 mL充分潤濕,加乙醚40 mL,25℃以下超聲(250 W,50 kHz)處理50 min,過濾,并用乙醚洗滌濾渣3次,每次10 mL,合并濾液后用旋轉蒸發儀揮干溶劑,甲醇溶解殘渣,轉移并定容至10 mL量瓶中,搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾得續濾液。

1.4 方法學考察

1.4.1 專屬性 精密吸取供試品與對照品溶液各10 μL，按“1.2”色譜與質譜條件進行測定。在此條件下6種生物堿的出峰時間分別為AC 3.09 min；MA 2.93 min；HA 3.16 min；BAC 2.75 min；BMA 2.67 min；BHA 2.82 min；LH 2.68 min。對照品及參附強心丸供試品溶液的色譜圖見圖1。

A.對照品；B.供試品；1.AC；2.MA；3.HA；4.BAC；5.BMA；6.BHA。

1.4.2 線性關系考察及定量下限測定 使用甲醇將“1.3.1”配置的對照品儲備液按梯度稀釋得對照品工作液。其中AC的線性濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL，MA的線性濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL，HA的線性濃度為10、20、40、60、80、100 mg/mL，BAC的線性濃度為120、240、480、720、96、1200 mg/mL，BMA的線性濃度為500、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 mg/mL，BHA的線性濃度為30、60、120、180、240、300 mg/mL，所有溶液均按“1.2”色譜與質譜條件進行測定，記錄各分析物的峰面積AS和內標LH的峰面積AIS，以AS與AIS的比值Y為縱坐標，濃度X為橫坐標，作加權線性回歸計算權重系數為1/χ2，AC、MA、HA、BAC、BMA、BHA的最低檢測限(LOD)、定量限(LOQ)、回歸方程、回歸系數等參數見表2，信噪比S/N均大于10。

表2 各成分線性關系

1.4.3 精密度試驗 按“1.2”色譜與質譜條件進行測定。對同一混合對照品溶液24 h內重復進樣6次，6種生物堿成分的峰面積的RSD分別為AC 2.82%；MA 3.33%；HA 3.40%；BAC 3.21%；BMA 2.15%；BHA 2.54%，表明日內精密度良好。精密吸取“1.3.1”項下同一混合對照品溶液，每日進樣1次，連續3 d，測得6種生物堿成分的峰面積的RSD分別為AC 4.20%；MA 3.70%；HA 1.93%；BAC 3.34%；BMA 2.63%；BHA 4.09%，日間精密度良好。

1.4.4 重復性試驗 取批號5150013的參附強心丸6份，按“1.3.3”方法制備得供試品溶液6份，按“1.2”色譜與質譜條件進行測定。測得參附強心丸中6種生物堿成分的平均質量分數與RSD分別為AC：1.98 mg/mL、2.00%；MA：2.69 mg/mL、1.08%；HA：13.74 mg/mL、2.51%；BAC：341.50 mg/mL、1.38%；BMA：628.79 mg/mL、1.58%；BHA：44.97mg/mL、1.92%，重復性良好。

1.4.5 穩定性試驗 取批號為5150013的同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8、10、12、24 h在上述條件進行測定。測得參附強心丸中6種生物堿成分的相對標準偏差分別為AC 3.06%；MA 1.76%；HA 2.08%；BAC 1.33%；BMA 0.73%；BHA 1.32%，供試品溶液在24 h內相對穩定。

1.4.6 加樣回收率試驗 取9份已知6種生物堿含量的參附強心丸(批號5150013)，按6種生物堿含量的80%、100%、120%(同一比例配置3份)添加混合對照品溶液后按“1.3.3”項下制備供試品溶液，在上述條件下測定AC、MA、HA、BAC、BMA、BHA的平均加樣回收率(n=6)分別為93.25%、95.28%、100.76%、96.92%、94.52%、96.37%;RSD分別為3.02%、3.66%、3.39%、1.69%、1.20%、2.44%。

1.5 數據分析 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。采用t檢驗對標準曲線回歸系數進行檢驗，P<0.05表明兩參量間存在直線關系。

2 結果

精密稱取3個批號的參附強心丸(批號5150009、5150012、5150013)各3份，按“1.3.3”項下制備，各成分含量結果如下。參附強心丸(批號5150009)中6種生物堿含量分別為AC 0.22 mg/kg，MA 0.29 mg/kg，HA 1.55 mg/kg，BAC 35.56 mg/kg，BMA 65.23 mg/kg，BHA 4.67 mg/kg。參附強心丸(批號5150012)中6種生物堿含量分別為AC 0.21 mg/kg，MA 0.25 mg/kg，HA 1.49 mg/kg，BAC 33.58 mg/kg，BMA 59.76 mg/kg，BHA 4.45 mg/kg。參附強心丸(批號5150013)中6種生物堿含量分別為AC 0.26 mg/kg，MA 0.35 mg/kg，HA 1.90 mg/kg，BAC 42.27 mg/kg，BMA 74.58 mg/kg，BHA 5.57 mg/kg。

有研究指出服用AC致成人中毒量為2 mg，為保證安全，AC每日服用量不得超過1 mg[12]。根據參附強心丸說明書中用法用量所述，每人每日最大服用劑量為6丸，按本實驗中測得附子中6種生物堿最高含量計算，參附強心丸中6種生物堿每日最大服用量為AC 1.58 μg，MA 2.11 μg，HA 11.39 μg，BAC 253.6 μg，BMA 447.5 μg，BHA 33.43 μg，遠低于中毒劑量。

3 討論

3.1 色譜條件的確定 參考文獻與待測物性質，考察了多種色譜柱與體系，最后確定采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，70%乙腈-水(含0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨)系統，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL。6種生物堿在此色譜條件下的出峰時間分別為AC 3.09 min，MA 2.93 min，HA 3.16 min，BAC 2.75 min，BMA 2.67 min，BHA 2.82 min。

3.2 質譜條件的確定 本實驗分別將各待測分析物及內標配制成1 mg/mL的溶液，用于注射泵連續進樣，以優化質譜參數。采用電噴霧電離源(ESI)，多反應離子監測模式(MRM)進行定量分析，并比較了正離子和負離子模式下離子峰強度，結果表明正離子條件下離子峰更穩定、強度最好。在正離子模式下，根據先前選定的母離子、子離子，組成離子對，做MRM掃描，分別優化DP、EP、CE、CXP等參數。

從檢測結果來看，各批次間參附強心丸中6種生物堿的含量仍存在一定差異，在后續研發中是否將此類毒效兼具的物質進行定量控制是一個值得思考的問題。此外，雖然參附強心丸中AC的含量遠遠達不到中毒劑量，但考慮附子中其他成分毒性及累加后可能會導致的毒性增加，因此有必要對其進行進一步的質量控制。

本實驗中建立的HPLC-MS/MS法較其他檢測方法耗時短，能于4 min內快速分離檢測出參附強心丸中的6種生物堿成分，方法簡單、靈敏、準確，可為參附強心丸的質量控制提供科學依據。