大黃?蟲丸對TGF-β1 干預后A549 細胞增殖的影響

蔣鋒利，蔡 松，任士杰，孫文麗，張 晶，趙明鏡，張立山

（北京中醫藥大學東直門醫院呼吸科，北京 100029）

關鍵字：肺絡干血；IPF；含藥血清；EMT；cck-8

特發性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種病因不明、慢性進展、致死性間質性肺疾病，以肺組織中存在“成纖維細胞灶”為特征，它是由成纖維細胞在內的間充質細胞聚集體和能表達a-SMA，并能促進有絲分裂及細胞外基質（ECM）分泌增加的肌成纖維細胞構成[1]。該病隸屬于中醫“肺痿”“肺痹”范疇，病性為本虛標實。武維屏、姜良鐸為代表的肺病專家提出“肺系絡病”理論，將本病病機概括為“氣虛血瘀、痰熱互結、痹阻肺絡”[2-3]。基于以上認識，本課題組提出“特發性肺纖維化患者存在肺絡干血”的假說，認為“肺絡干血是肺纖維化病因，細胞外基質沉積是干血實質”[4]。針對“干血”一證，張仲景治以“緩中補虛”之大黃?蟲丸，尤在涇將本方治法概括為“潤以濡其干，蟲以動其瘀，通以去其閉”，此實為仲景治療“干血”的三大法門。研究[5]證實大黃?蟲丸對博來霉素致特發性肺纖維化大鼠的保護作用可能通過抑制MMP-2 的產生來實現。本實驗選擇吡非尼酮作為陽性對照藥，通過制備不同濃度大黃?蟲丸含藥血清，對獲取的TGF-β1干預48h 后A549 細胞進行Masson 染色，使用cck-8 法觀察24 h、48 h、72 h大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1干預后的A549 細胞增殖情況的影響，探索大黃?蟲丸對IPF 防治作用的更多內在機制，進一步豐富捜剔肺絡法防治特發性肺纖維化的學術內涵。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞健康SD 雄性大鼠60 只，體質量250～300 g。由北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，SPF/VAF 級，許可證號：SCXK（京）2016－0006。人肺泡上皮A549 細胞株（中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，北京）。

1.2 藥物及試劑大黃?蟲丸（國藥準字：Z11020002，批號：17013170），購自北京同仁堂；吡非尼酮膠囊（國藥準字：H20133376，批號：190505），購自北京康蒂尼藥業。均在常溫干燥處保存。DMEM/F-12培養基（Biological Industries），FBS（Biological Industries），重組人TGF-β1（PeproTech），0.25%Trypsin EDTA（Biological Industries），PBS（Biological Industries），青-鏈霉素（Caisson Labs），cck-8（北京北仁化學），戊巴比妥鈉（中國醫藥北京公司）。

1.3 主要儀器超凈工作臺FLC-3型（哈爾濱市東聯），二氧化碳培養箱MC0175 型（日本SANYO），離心機5417R 型（德國Eppendorf），倒置顯微鏡CKX41 型（日本OLYMPUS），全景掃描儀Pannoramic MIDI 型（匈牙利3D HISTECH），酶標儀352 型（芬蘭Thermo Multiskan MS）。

1.4 方法

1.4.1 大黃?蟲丸含藥血清的制備及保存 SD 大鼠適應性喂養3 d 后，參考盧磊[6]等人方法，按人與動物等效劑量換算法，分別算得大黃?蟲丸高、中、低及吡非尼酮給藥劑量為1.8、0.9、0.4 5、0.18 mg·kg-1·d-1，以上劑量分別各給10 只SD 大鼠灌服，每日1 次，持續7 d。末次給藥1 h 后，3%戊巴比妥鈉（0.15 mL·100 g-1）腹腔內麻醉，無菌條件腹主動脈取血，冰上靜置2 h，4℃，3 000 r·min-1離心15 min 取上清，分裝并標記，56℃滅活30 min，-80 ℃快速凍固保存，待用。剩余20 只SD 大鼠灌以等量等滲鹽水，以同樣方法制備空白血清并保存，待用。

1.4.2 IPF 細胞模型的建立 參照Kasai H 等的方法復制特發性肺纖維化細胞模型[7]。實驗分為空白對照組（K 組）、模型組（M 組）。收集對數生長期A549細胞，調整細胞懸液濃度至5×104·mL-1，每孔2 mL接種于12 孔板，2 組均設3 個復孔，邊緣孔用無菌PBS 填充，37 ℃、5%CO2條件下，培養24 h，換用無血清DMEM/F-12 培養基，繼續培養24 h，換液，K 組每孔加入2 mL 培養基，M 組每孔加入2 mL 含TGF-β1（5 ng·mL-1）培養基，繼續培養48 h，倒置顯微鏡下拍照，見圖1。

1.4.3 Masson 染色 重復1.4.2 中分組及實驗過程，獲取TGF-β1（5 ng·mL-1）干預48 h 后A549 細胞。0.01 mol·L-1無菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min，4%的多聚甲醛室溫固定15 min，0.01 mol·L-1無菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min，常規Masson 染色后，全景掃描儀記錄圖像，見圖2。

1.4.4 實驗分組及cck8 法觀察各組細胞生長情況 選擇吡非尼酮作為陽性對照藥。實驗分為空白對照組（K組）、模型組（M 組）、西藥組（P 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清大劑量組（D 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清中劑量組（Z 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清小劑量組（X組）。收集對數生長期A549細胞，調整細胞懸液濃度至5×104·mL-1，每孔100 uL 接種于96 孔板，各組均設6 個復孔，邊緣孔用0.01 mol·L-1無菌PBS 填充，37℃，5% CO2條件下培養。24 h 后，換用無血清DMEM/F-12 培養基，繼續培養24 h，吸棄孔內培養基，加入100 uL 對應的10%含藥血清及含5 ng·mL-1的TGF-β1培養基。分別于24 h、48 h、72 h 后，盡量吸棄孔內培養基，統一加入含10% cck-8無血清培養基100 uL，37 ℃繼續培養1.5 h，酶標儀450 nm 波長處檢測并記錄OD 值，計算各實驗組增殖率，過程需注意避光。增殖率（%）=（給藥組-空白組）OD 值/空白組OD 值×100%。

1.5 統計學方法采用SPSS 25.0 軟件進行分析，滿足正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 特發性肺纖維化細胞模型的鑒定倒置顯微鏡下，M 組A549 細胞經TGF-β1誘導，形態逐漸由鵝卵石狀變為伸長的紡錘形或梭形，細胞圓形度降低，與成纖維細胞、肌纖維母細胞形態相似。圖1 為TGF-β1干預A549 細胞48 h 細胞形態。Masson 三色染色法是膠原纖維染色經典而又權威的技術方法。該法染色原理與陰離子燃料分子的大小和組織的滲透有關，小分子量易穿透結構致密、滲透性低的組織；而大分子量則只能進入結構疏松、滲透性高的組織。因此Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍色，胞核呈藍褐色。圖2 為TGF-β1干預A549 細胞48 h 后Masson 染色結果，結合圖1 說明發生EMT，即特發性肺纖維化細胞模型成功。

圖1 TGF-β1 誘導A549 細胞48 h（白光片，×400）

圖2 TGF-β1 誘導A549 細胞48 h 后Masson 染色（全景掃描儀，×400）

2.2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖率影響見表1。

表1 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖率影響（，n=6） %

表1 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖率影響（，n=6） %

注：與K 組比較，正值為促進作用，負值為抑制作用

2.3 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖OD 值影響見表2。

表2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖OD 值影響（，n=6）

表2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預后A549 細胞的增殖OD 值影響（，n=6）

注：與P 組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與K 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與M 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

3 討論

如表1、表2 中所示結果，24 h 時，K 組所得OD值最高，且與其他各組比較均有顯著性差異（P＜0.01），可能與經TGF-β1誘導后A549 細胞發生EMT，部分肺腺癌細胞變為間充質細胞后，增殖能力降低有關；各組所得增殖率依次為Z 組、X 組、M 組、D 組、P 組，各組對比有差異，但無統計學意義（P≥0.05），提示TGF-β1干預24 h 后A549 細胞未發生EMT，可認為是特發性肺纖維化發病早期。48 h 時，K 組所得OD值均高于其他各組，且與之相比均有顯著性差異（P＜0.01）；各組所得增殖率依次為M組、Z組、X組、P組、D 組，與M 組相比，除Z 組無統計學意義外，其他各組均有顯著性差異，提示TGF-β1干預48 h 后A549 細胞部分發生EMT[8]，可認為是特發性肺纖維化發病中期，各藥物組對該期特發性肺纖維化保護作用較早期明顯。72 h 時，K 組所得OD 值仍最高，但與M 組無統計學差異，可能與A549 細胞生長過快，培養基消耗太多，影響其增殖有關；各組所得增殖率依次為M組、D 組、Z 組、P 組、X 組，與M 組相比，X 組、P組有顯著性差異，提示TGF-β1干預72 h 后的A549 細胞已全部發生EMT，可認為是特發性肺纖維化發病晚期，各藥物組對本期特發性肺纖維化保護作用最明顯，且以X 組最優。

24 h 時，K 組與其他組比較均有顯著性差異，且48 h、72 h 時，P 組、D 組、Z 組及X 組對TGF-β1干預后A549 細胞增殖率均不同程度高于M 組。提示各實驗組不僅不同程度阻斷或逆轉了TGF-β1誘導的EMT，對A549 細胞也具有一定殺傷作用，即吡非尼酮與大黃?蟲丸亦具有不同程度的抗腫瘤效用[9-10]，亦從實驗角度驗證了中醫“一方多病”的科學[11-12]。原文方后注曰“上十二味，煉蜜和丸小豆大，酒飲服五丸，日三服”[13]。在本實驗中，為方便對大鼠進行灌胃，由“丸”改“湯”，亦未用酒，得到大黃?蟲丸抗纖維化作用以中小劑量使用為佳的結果。臨床應用本方時，用量選擇上自不能以此作為主要依據，仍需臨證綜合考量。

EMT 在多種病理過程中發揮著重要作用，它可能是致病間充質細胞主要來源[14]。TGF-β1是一種多功能細胞因子，具有促進細胞增殖、分化、凋亡及ECM形成等生物活性[15-16]，被認為是誘導包括肺在內諸多臟器纖維化的“主開關”[17]。TGF-β1首先被描述為正常乳腺上皮細胞中發生EMT 的誘導劑[18]，之后的研究中，TGF-β1作為EMT 誘導劑在包括肝臟、腎近端小管、晶狀體等上皮細胞中亦被證實[19]。在特發性肺纖維化動物模型中，模型組TGF-β1分泌量顯著高于正常組，并加速了特發性肺纖維化的疾病進程[20-21]，在體外可以促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉變，促進EMT，保護成纖維細胞免于凋亡和促進活性氧（ROS）的產生[22]。

在特發性肺纖維化進展過程中，肺泡及氣道上皮中均發現EMT 存在，其中，肺泡上皮（AEC）是肺纖維化的主要致病介質[23-24]。考慮到AEC 損傷在特發性肺纖維化過程中的重要作用及可塑性，前期關于體內外發生EMT 潛力的相關實驗表明，小鼠AEC 和AT2細胞系在含TGF-β1細胞培養基中均發生了EMT[25]。Yasuoka H 等[26]的研究表明，過表達IGFBP-5 小鼠纖維化模型的肺中AEC 共表達了E-cad 和a-SMA，提示存在EMT。特發性肺纖維化患者肺中活化AEC 可以合成分泌多種促凝血因子（如PAI-1/2）、促纖維化因子（如TGF-β、TNF-α、PDGF），這些細胞因子可以在AEC 和成纖維細胞之間相互傳遞信號，進而影響到彼此的增殖和凋亡[27]。特發性肺纖維化患者肺活檢中，發現纖維母細胞灶80%以上增生上皮細胞中共表達上皮（Nkx2.1、促生蛋白B）和間充質（a-SMA）標志，提示EMT 是體內發生特發性肺纖維化的重要病理過程，且指出該過程受ECM 調節[28]。此外，Ward 等[29]在研究中發現，取自臨床穩定的肺移植受體氣道上皮細胞具有EMT 特征。

綜上所述，AEC 損傷與重塑及TGF-β1誘導EMT在特發性肺纖維化發病過程中起到至關重要的作用。特發性肺纖維化患者中位生存期約2.8 年，被稱為“類腫瘤疾病”，治療上除氧療和肺移植外，包括吡非尼酮及尼達尼布在內，尚無具有確切療效的藥物，這一現狀急需改變[30]。本實驗結果表明，大黃?蟲丸對特發性肺纖維化的保護機制可能與不同程度阻斷或逆轉了TGF-β1誘導的EMT 有關。這也為大黃?蟲丸可以作為特發性肺纖維化患者潛在有效治療藥物提供了更多的實驗依據。