CDCA7通過與MCM3相互作用介導胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移

鄧 路 ，何志偉 ，朱昌毫，陳世裕，劉燕青，李 琳，孫誠誼，喻 超

[作者單位]1.貴州醫科大學臨床醫學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院肝膽外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學肝膽胰脾重點實驗室，貴州 貴陽 550004；4.貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004

胰腺癌的惡性程度高，2019年美國腫瘤年度報告指出，胰腺癌死亡率在所有腫瘤中位列第6，5年生存率低于7%[1]。隨著臨床醫療水平的提高，針對胰腺癌患者的系統治療也在不斷地改善。目前認為，早期手術切除是治療胰腺癌最有效的方式，但由于胰腺癌發病隱匿，早期診斷極為困難，大多數患者在確診時已錯過了最佳的手術時機[2]。而且胰腺癌發展迅速，預后差，其原因是胰腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力很強[3]。因此，研究胰腺癌細胞增殖、侵襲及遷移的生物學功能和分子機制有助于闡明胰腺癌的發生和發展過程，利于早期診斷和治療。

細胞分裂周期相關蛋白7（cell division cycleassociated protein 7，CDCA7）基因又名JPO1，是一種新型c-Myc應答基因，定位于人染色體2q31上，編碼由371個氨基酸組成的核蛋白[4]。JPO1基因在細胞周期中周期性表達，在G1和S期之間達到最高水平，2005年被人類基因組命名委員會正式命名為CDCA7[5]。研究發現，CDCA7與Myc具有關聯，而且這種關聯受磷酸化依賴方式調節。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）可使CDCA7的第163位點蘇氨酸發生磷酸化，促進與14-3-3蛋白（14-3-3 proteins，14-3-3）的結合，與Myc分離，并被轉運到細胞質中[6]。以往對CDCA7基因的研究主要集中在CDCA7和Myc之間的相互作用上[4,6-7]，而對CDCA7基因本身的功能和機制研究較少。已有研究表明，CDCA7基因是轉錄因子Myc和E2F轉錄因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）的下游靶基因，參與細胞周期過程，可作為很多基因的表達轉錄調控因子，提示其很可能通過調控某一基因的表達來調控細胞的增殖或凋亡，從而引起腫瘤的發生和發展[8]。

近年來，有研究者相繼報道了CDCA7基因在人類腫瘤中的表達情況[9-11]，發現各種腫瘤中CDCA7的表達量均有顯著增高，但是CDCA7基因是否參與胰腺癌的發生和發展尚待進一步研究。本研究主要從增殖、侵襲及轉移等方面探討CDCA7在胰腺癌中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑

人正常胰腺導管上皮細胞HPDE和人胰腺癌細胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細胞均由武漢華中科技大學同濟醫學院膽胰實驗室惠贈。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM及RPMI 1640培養液購自美國Gibco公司。兔抗人CDCA7多克隆抗體購自美國Affanity公司，兔抗人微型染色體維持蛋 白3（minichromosome maintenance protein 3，MCM3）多克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體、小鼠抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體和小鼠抗人cyclin E1單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，鼠抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔IgG（二抗）、高靈敏化學發光檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，Protein A＋G瓊脂糖和CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司，基質膠（Matrigel）購自美國BD公司，RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒及SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司。攜帶CDCA7-shRNA的重組慢病毒及陰性對照病毒、HitransG A病毒感染試劑購自上海吉凱基因化學技術有限公司；CDCA7-shRNA（CDCA7-shRNA1序列：5’-GACTATTGATACCAAAACA-3’，CDCA7-shRNA2序列：5’-GTGCATGCCTACTTGAAAA-3’，CDCA7-shRNA3序列：5’-CCAACTCCGATTCAGAAGA-3’）。CDCA7基因引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司設計并完成；CDCA7基因上游引物序列為5’-GAGAACGTCTGCAGCAATTC-3’，下游引物序列為5’-ATCCCTGACCTCTTCACCATA-3’；GAPDH基因（內參照）上游引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2 生物信息學分析

利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表達譜數據動態分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數據庫（http://gepia2.cancer-pku.cn）網站，依次選擇Expression Analysis和Genaral，輸入基因名稱CDCA7，分析數據庫中各種腫瘤組織和正常組織中CDCA7的表達水平；進一步在GEPIA網站中選擇Expression DIY，輸入基因名稱CDCA7，選擇胰腺導管腺癌數據庫PAAD，在線分析CDCA7在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達。利用STRING網站（https://version11.string-db.org）在線分析，選擇胰腺導管腺癌數據庫PAAD，輸入基因名稱CDCA7，進行數據庫分析，結果顯示CDCA7與MCM3存在相互作用；進一步利用GEPIA數據庫網站，依次選擇Correlation Analysis和胰腺導管腺癌數據庫PAAD，輸入CDCA7和MCM3，在線分析CDCA7和MCM3蛋白存在相關性。

1.3 細胞培養

人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE和人胰腺癌細胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細胞分別用含10%胎牛血清的DMEM及RPMI 1640培養液培，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的恒溫恒濕培養箱中進行培養。

1.4 實時熒光定量PCR檢測人正常胰腺導管上皮細胞和胰腺癌細胞中CDCA7 mRNA的表達水平

收集處于對數生長期的各組細胞（人正常胰腺導管上皮細胞HPDE和人胰腺癌細胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細胞），提取細胞總RNA，選取D260nm/D280nm值在1.8～2.0的樣品進行PCR擴增。取800 ng總RNA，反轉錄為cDNA；反轉錄體系（20 μL）：5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript反轉錄酶混合液1 μL，Oligo dT引物1 μL，隨機的6核苷酸引物1 μL，總RNA 800 ng，然后用無酶水補充體積至20 μL。按照反轉錄試劑盒的說明，將200 μL無酶EP管置于反轉錄儀器內，條件參數設置為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將樣品反轉錄為cDNA。再選擇GAPDH基因作為內參，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增，反應體系：SYBR Premix Ex Taq 6.25 μL，CDCA7基因或GAPDH基因上下游引物各0.25 μL，cDNA 1.0 μL，無酶水4.75 μL；PCR擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環。以2－ΔΔCt值表示目的基因的相對表達水平。

1.5 蛋白質印跡法檢測人正常胰腺導管上皮細胞和胰腺癌細胞中CDCA7蛋白的表達水平

將生長狀態良好的各組細胞（人正常胰腺導管上皮細胞株HPDE和人胰腺癌細胞株Bxpc-3、CFPAC-1、PANC-1、MIA PaCa-2、Capan2及SW1990細胞）用胰蛋白酶消化后，裂解細胞提取細胞總蛋白，將處理后的蛋白樣品行SDSPAGE，電泳結束后將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉2 h；加入一抗[兔抗人CDCA7多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000）]4 ℃反應過夜；隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔IgG（體積稀釋比例均為1∶5 000）]進行反應，最后加入高靈敏電化學發光劑曝光、顯影。以目蛋白條帶與內參照GAPDH蛋白條帶灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.6 重組慢病毒感染

選取對數期生長的PANC-1細胞接種于6孔板中，調整細胞密度為1×105個/孔，用HitransG A病毒感染試劑進行重組慢病毒感染。實驗分組如下：空白對照組，不對細胞進行處理的PANC-1細胞；陰性對照（negativecontrol，NC）-shRNA組，用NC-shRNA重組慢病毒感染PANC-1細胞；CDCA7-shRNA1組、CDCA7-shRNA2組和CDCA7-shRNA3組，分別用CDCA7-shRNA1、CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3重組慢病毒感染PANC-1細胞，構建CDCA7干擾組。感染流程嚴格按照HitransG A病毒感染試劑說明書進行操作，篩選穩定表達的細胞株，并分別采用實時熒光定量PCR法和蛋白質印跡法檢測感染效率（檢測流程參閱1.4節和1.5節）。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖

收集NC-shRNA組、CDCA7-shRNA2組和CDCA7-shRNA3組PANC-1細胞消化并計數，按照3×103個/孔的密度接種于96孔板中（每組細胞設置5個復孔），分別于24、48及72 h共3個時間點檢測PANC-1細胞的增殖能力；每孔均加入CCK-8試劑10 μL，在避光條件下置于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，取出后輕微振蕩搖勻，置于酶聯免疫檢測儀上450 nm波長處檢測各孔的D值，并繪制生長曲線。

1.8 平板克隆實驗

收集處于對數生長期的各組細胞（細胞分組同1.7節）消化并計數，以1×103個細胞/孔的密度接種于6孔板中，置于37 ℃恒溫箱中培養10～14 d后，用4%多聚甲醛溶液固定20～30 min，再用0.1%結晶紫染液染色20～30 min，流水沖洗后置于烘干箱中烘干，拍照記錄克隆生長情況，以＞50個細胞的克隆計為1個克隆。

1.9 細胞劃痕愈合實驗

收集處于對數生長期的各組細胞（細胞分組同1.7節）消化并計數，以4×105個細胞/孔的密度接種于6孔板中，待其均勻單層鋪滿至90%時，用200 μL移液器槍頭置于各孔上方，沿直尺垂直均勻地劃線，用PBS清洗劃下的細胞，加入不含胎牛血清的培養液，分別于0、24及48 h時置于倒置光學顯微鏡（放大倍數為40倍）下拍照記錄細胞的遷移距離。

1.10 細胞侵襲及遷移實驗

收集處于對數生長期的各組細胞（細胞分組同1.7節）用無血清培養液饑餓處理24 h后消化計數，將Matrigel與無血清培養液按照1∶8的體積比例稀釋，取60 μL稀釋后的Matrigel鋪在Transwell小室的上室膜上，待膠凝固后。在上室中接種1×105個/孔的細胞懸液200 μL，下室加入600 μL含20%胎牛血清的細胞培養液，置于37 ℃恒溫箱中孵育24～48 h后，用4%多聚甲醛溶液固定細胞20～30 min，再用0.1%結晶紫染液染色20～30 min，用棉簽輕輕除去上室中未穿過小室的細胞，置于烘干箱中烘干；最后在倒置光學顯微鏡（放大倍數為400倍）選取5個視野拍照記錄并計數穿過小室膜的細胞數。Transwell小室遷移實驗中不鋪設Matrigel，其余步驟同前述的侵襲實驗。

1.11 蛋白質印跡法檢測干擾CDCA7表達后對PANC-1細胞中上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）相關蛋和細胞周期蛋白表達水平的影響

收集處于對數生長期的各組細胞（細胞分組同1.7節）采用蛋白質印跡法檢測PANC-1細胞中CDCA7、Vimentin、E-cadherin、cyclin D1和cyclin E1蛋白的表達水平，其中一抗分別為兔抗人CDCA7多克隆抗體、兔抗人Vimentin單克隆抗體、小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、兔抗人cyclin D1單克隆抗體、小鼠抗人cyclin E1單克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（內參照）（體積稀釋比例均為1∶1 000）；檢測流程參閱1.5節。

1.12 免疫共沉淀實驗

在PANC-1細胞中共轉染pFlag-CDCA7和p-MCM3重組慢病毒，將生長狀態良好的PANC-1細胞用胰蛋白酶消化后，裂解細胞抽提細胞總蛋白；加入20 μL充分重懸的Protein A＋G瓊脂糖，4 ℃搖床2 h，加入2 μL兔抗人CDCA7多克隆抗體，4 ℃搖床上處理過夜；加入20 μL充分重懸的Protein A＋G瓊脂糖，離心去除上清液，加入40 μL 2×上樣緩沖液，將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物重懸沉淀，瞬時離心把樣品離心至管底；95 ℃煮沸5 min，取部分或者全部樣品用于SDS-PAGE，電泳結束后分別用兔抗人CDCA7多克隆抗體和兔抗人MCM3多克隆抗體檢測CDCA7和MCM3蛋白的表達水平，檢測流程參閱1.5節。

1.13 統計學方法

2 結果

2.1 人胰腺癌組織中CDCA7高表達

對TCGA和GEPIA數據庫中的腫瘤相關數據分析結果（圖1A）顯示，CDCA7在各種類型的癌組織和正常組織中的表達水平均不同。進一步分析CDCA7在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達情況，結果（圖1B）顯示胰腺癌組織中CDCA7的表達水平明顯提高（P＜0.05）。

2.2 人胰腺癌細胞系中CDCA7的表達情況

分別采用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法檢測結果胰腺癌細胞系中CDCA7 mRNA和蛋白的表達水平。實時熒光定量PCR法檢測結果（圖2A）顯示，胰腺癌PANC-1、MIA PaCa-2和SW1990細胞的CDCA7 mRNA的表達水平均高于人正常胰腺導管上皮細胞HPDE中CDCA7 mRNA的表達水平（P值均＜0.05），而胰腺癌Bxpc-3、CFPAC-1和Capan2細 胞 中CDCA7 mRNA的表達水平則均低于人正常胰腺導管上皮細胞HPDE（P值均＜0.05）。蛋白質印跡法檢測結果（圖2B）同樣顯示，胰腺癌PANC-1、SW1990和MIA PaCa-2細胞中CDCA7蛋白的表達水平高于HPDE細胞，并以在PANC-1細胞中的表達水平最高。因此，選擇PANC-1細胞進行后續實驗。

2.3 重組慢病毒感染后PANC-1細胞中CDCA7 mRNA和蛋白表達水平的變化

實時熒光定量PCR法檢測結果（圖3A）顯示，與空白對照組和NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA1組PANC-1細胞中CDCA7 mRNA的表達水平無明顯變化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組中CDCA7 mRNA的表達水平均明顯下調（P值均＜0.05）。

蛋白質印跡法檢測結果（圖3B）同樣顯示，與空白對照組和NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA1組PANC-1細胞中CDCA7蛋白的表達水平無明顯變化，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組中CDCA7 mRNA的表達水平均明顯下調（P值均＜0.05）。

因此，選擇CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組用于后續CDCA7干擾后的細胞功能研究。

2.4 干擾CDCA7表達后PANC-1細胞增殖能力變化

CCK-8法檢測結果（圖4A）顯示，48和72 h時，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細胞的增殖能力明顯降低（P＜0.05和P＜0.01）。

平板克隆實驗結果（圖4B）顯示NCshRNA組中細胞集落數為（309.2±10.0）個，CDCA7-shRNA2組為（165.3±7.0）個，CDCA7-shRNA3組為（160.7±6.0）個，提示干擾CDCA7表達后PANC-1細胞的增殖能力明顯減弱（P值均＜0.05）。

上述結果提示，干擾CDCA7表達能顯著抑制PANC-1細胞的增殖能力。

2.5 干擾CDCA7表達對PANC-1細胞侵襲及遷移能力的影響

細胞劃痕愈合實驗結果（圖5A）顯示，在相同的時間內，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細胞的遷移距離變短，差異有統計學意義（P值均＜0.05）。

Transwell小室遷移及侵襲檢測結果（圖5B）顯示，NC-shRNA組發生遷移的細胞數為（606±6）個，發生侵襲的細胞數為（417±10）個，CDCA7-shRNA2組發生遷移的細胞數為（346±6）個，發生侵襲的細胞數為（268.5±8.5）個，CDCA7-shRNA3組發生遷移的細胞數為（352±9）個，發生侵襲的細胞數為（275±6）個，與NC-shRNA組相比，CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3組PANC-1細胞的發生遷移和侵襲的細胞數均明顯減少（P值均＜0.05）。

Fig.1 The expression of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) in different tumors and normal tissues (A),and the expression of CDCA7 in pancreatic cancer and normal pancreatic tissues (B) were analyzed by The Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA) databases.ACC:Adrenal cortical carcinoma;BLCA:Bladder urothelial carcinoma;BRCA:Breast invasive carcinoma;CESC:Cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma;CHOL:Cholangiocarcinoma;COAD:Colon adenocarcinoma;DLBC:Lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma;ESCA:Esophageal carcinoma;GBM:Glioblastoma multiforme;HNSC:Head and neck squamous cell carcinoma;KICH:Kidney chromophobe;KIRC:Kidney renal clear cell carcinoma;KIRP:Kidney renal papillary cell carcinoma;LAML:Acute myeloid leukemia;LGG:Brain lower grade flioma;LIHC:Liver hepatocellular carcinoma;LUAD:Lung adenocarcinoma;LUSC:Lung squamous cell carcinoma;OV:Ovarian serous cystadenocarcinoma;PAAD:Pancreatic adenocarcinoma;PCPG:Pheochromocytoma and paraganglioma;PRAD:Prostate adenocarcinoma;READ:Rectum adenocarcinoma;SARC:Sarcoma;SKCM:Skin cutaneous melanoma;STAD:Stomach adenocarcinoma;TGCT:Testicular germ cell tumors;THCA:Thyroid carcinoma;THYM:Thymoma;UCEC:Uterine corpus endometrial carcinoma;UCS:Uterine carcinosarcoma;TPM:Transcript per million.圖1 采用TCGA數據庫分析CDCA7在不同腫瘤（A）及胰腺癌及其癌旁組織（B）中的表達情況

Fig.2 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in human normal pancreatic ductal epithelial HPDE cells and pancreatic cancer PANC-1,MIA PaCa-2,SW1990,CFPAC-1,Capan 2 and Bxpc-3 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blotting,respectively.*P＜0.05, vs HPDE cells (n=3).圖2 分別采用實時熒光定量PCR法（A）和蛋白質印跡法（B）檢測人正常胰腺導管上皮細胞和胰腺癌細胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表達水平

上述結果提示，干擾CDCA7表達后能明顯抑制PANC-1細胞的遷移和侵襲能力。

Fig.3 The expression levels of cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) mRNA (A) and protein(B) in PANC-1 cells transfected with CDCA7-shRNA were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Blank:PANC-1 cells were infected with the empty vector lentivirus;NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA1,CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,***P＜0.001 (n=3).圖3 分別采用實時熒光定量PCR法（A）和蛋白質印跡法（B）檢測轉入CDCA7-shRNA后對PANC-1細胞中CDCA7 mRNA和蛋白的表達水平的影響

Fig.4 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the proliferation of PANC-1 cells was detected by CCK-8 (A) and colony formation assay (B),respectively.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,**P＜0.01,vs NC-shRNA (n=3).圖4 分別采用CCK-8（A）和平板克隆實驗（B）檢測干擾CDCA7表達對胰腺癌細胞增殖能力的影響

Fig.5 After cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering,the invasion and migration abilities of PANC-1 cells were detected by wound healing assay (A) and Transwell chamber assay (B).NCshRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).圖5 分別采用細胞劃痕愈合實驗（A）和Transwell小室遷移和侵襲實驗（B）檢測干擾CDCA7表達對胰腺癌PANC-1細胞遷移（A）及侵襲（B）能力的影響

2.6 干擾CDCA7表達后對EMT相關蛋白和細胞周期蛋白表達水平的影響

蛋白質印跡法檢測結果（圖6）顯示：與NC-shRNA組比較，2個CDCA7-shRNA組（CDCA7-shRNA2和CDCA7-shRNA3）PANC-1細胞中EMT相關蛋白Vimentin和細胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的表達水平均明顯下調，但E-cadherin蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）。

2.7 CDCA7與MCM3存在相互作用

通過STRING和GEPIA數據庫進行CDCA7與其他蛋白相關性的分析，結果（圖7A和7B）顯示，CDCA7與MCM2～7復合物顯著相關（P＜0.05），提示CDCA7與MCM蛋白可能存在密切聯系。進一步在PANC-1細胞中共轉染攜帶有pFlag-CDCA7和p-MCM3的慢病毒，通過免疫共沉淀實驗檢測CDCA7與MCM3之間的相互作用情況。免疫共沉淀法檢測結果（圖7C）顯示，CDCA7與MCM3存在相互作用關系；蛋白質印跡法檢測結果（圖7D）顯示，干擾CDCA7表達后MCM3蛋白的表達水平明顯下調。

Fig.6 The expression levels of epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related protein Vimentin and E-cadherin proteins,as well as cell cycle protein cyclin D1 and cyclin E1 after cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) gene interfering were detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3.*P＜0.05,vs NC-shRNA (n=3).圖6 干擾CDCA7表達后對PANC-1細胞中EMT相關蛋白Vimentin和E-cadherin以及細胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E1表達水平的影響

Fig.7 The expression correlation between cell division cycle-associated protein 7 (CDCA7) and minichromosome maintenance protein 3 (MCM3) was analyzed by STRING database (A) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) databases (B).The interaction between CDCA7 and MCM3 in PANC-1 cells was detected by coimmunoprecipitation assay (C);The MCM3 protein expression level after (CDCA7) gene interfering was detected by Western blotting.NC-shRNA:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying negative control (NC)-shRNA;CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3:PANC-1 cells were infected with the recombinant lentivirus carrying CDCA7-shRNA2 and CDCA7-shRNA3;TPM:Transcript per million.圖7 CDCA7與MCM3之間的相關性

3 討論

CDCA7定位于染色體2q31，其突變會導致免疫缺陷-著絲粒不穩定性-面部異常綜合征[12]。CDCA7在食管癌[13]、結直腸癌[14]、乳腺癌[10]、肺腺癌[15]等腫瘤中高表達，參與調節腫瘤的增殖、侵襲及遷移過程，且與患者預后密切相關。本研究通過GEPIA數據庫分析發現，CDCA7在胰腺癌中高表達。進一步通過實時熒光定量PCR法和蛋白質印跡法檢測發現，與人正常胰腺上皮細胞HPDE相比，CDCA7在部分胰腺癌細胞中高表達，提示CDCA7可能參與了胰腺癌的惡性生物學過程。

有研究報道，CDCA7可通過上調組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶EZH2（histone-lysine N-methyltransferase）蛋白的表達水平，促進乳腺癌細胞的侵襲及遷移[10]。當前，有關CDCA7對胰腺癌細胞腫瘤生物學行為的影響尚未有較多報道。因此，本項研究通過利用PANC-1細胞來構建干擾CDCA7表達的穩定細胞株，進一步采用CCK-8法、平板克隆實驗、細胞劃痕實驗和Transwell小室遷移和侵襲實驗檢測沉默CDCA7表達對PANC-1細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為的影響。本研究結果顯示，在沉默CDCA7表達后，PANC-1細胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯受到抑制。

已有研究結果顯示，MCM3是一種DNA復制許可因子，由MCM2～7復合物組；MCM2～7復合物是在真核細胞中DNA復制起始和延伸所必需的復制解旋酶[16]。在DNA復制許可的過程中，MCM通過結合細胞周期的M晚期到G1早期的DNA復制起點，誘發染色質進行DNA復制，通過S期促進蛋白激酶激活，與原點結合的MCM復合物在原點解開雙鏈DNA，募集DNA聚合酶并啟動DNA合成[17]。由于MCM在增殖細胞的基因組復制中起著至關重要的作用，MCM功能失調可能導致染色體缺陷，從而誘發腫瘤。MCM蛋白在經歷惡性轉化的人類癌細胞和癌前細胞中高表達[17]。MCM在DNA復制和細胞周期進程中起著關鍵作用[18]。本研究進一步通過免疫共沉淀和蛋白質印跡法驗證發現，CDCA7和MCM3存在相互作用，沉默CDCA7基因表達后MCM3蛋白的表達水平也隨之下調存在，提示二者存在相關性

綜上所述，本研究在體外初步驗證了沉默CDCA7基因表達后胰腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移能力受到抑制，并且可能通過與MCM2～7復合物的結合來調控胰腺癌的惡性生物學過程，有望為尋求治療胰腺癌的新的分子靶點提供思路。然而，CDCA7的具體作用途徑及分子生物學機制尚未明確，還要進一步的實驗探索來闡明。