多肽18F標記方法研究進展

楊鴻章，牟釗彪，李子婧

(廈門大學公共衛生學院,分子影像暨轉化醫學研究中心，福建廈門361102)

分子影像技術能反映機體組織、細胞及分子水平的代謝和功能狀態變化，是疾病早期診斷的利器，可為個體化治療提供指導，在新藥研發領域也有著很好的應用前景[1-2].其中，正電子發射斷層成像(PET)具有高靈敏度、無創、高穿透深度等優勢，已廣泛用于腫瘤、神經系統及心血管系統等疾病的診斷和研究.

表征特定生理功能或靶向病理標志物的正電子發射分子探針是PET成像的基礎，通常由正電子發射核素和高親和性的配體組成[3].在能夠發射正電子的放射性核素中，氟-18(18F)具有優良的核素性質,適用于醫學成像，如：1) 最大正電子能量(635 keV)較低，使得正電子湮沒前在組織中穿行距離較短，從而提供較高分辨率的圖像[4-5]；2) 半衰期(109.8 min)適中，可避免受試者長時間照射，但仍滿足標記化學、體內顯像和遠程配送的需求，廣泛用于PET探針合成[6].

多肽作為靶向特定受體的優良配體，因具有多種優勢而受到廣泛的關注：1) 特異性高,組織穿透能力強；2) 分子量低，有利于多肽從血液和非靶組織中被快速清除，使得顯像有較高的靶與非靶比值；3) 由于生物同源性，多肽一般不具有免疫原性，安全性較高[7].因此，如何用放射性核素標記種類繁多的多肽進而制備多肽探針，逐漸成為疾病精準診斷和個性化治療領域的研究熱點.目前，放射性標記多肽主要通過99mTc、68Ga和177Lu等放射性金屬標記，但螯合基團相對龐大可能影響多肽的靶向性，不適用于多肽放射性標記[8-10].近年來報道了許多新型18F標記多肽的方法，并在溫和標記方面有重要發展.根據標記過程的復雜程度可系統地分為一步標記法、多步標記法和固相標記法.本文將分別對這些標記方法進行闡述.

1 一步18F標記多肽策略

1.1 基于生成C—18F鍵的一步標記方法

基于生成C—18F鍵的一步18F標記法按機理可分為親電取代反應、親核取代反應和自由基反應.其中，基于生成C—18F鍵的親電取代和親核取代反應已被廣泛應用于小分子標記，但標記條件較苛刻，且多肽對高溫、有機溶劑、強酸等反應條件較敏感，因此相關報道相對較少；而近年來開發的基于C—18F鍵生成的自由基反應，標記條件較溫和,區域選擇性好，應用前景廣闊.

1.1.1 基于芳香環親電反應的一步18F標記多肽方法

2003年，Ogawa等[11]利用氟乙酰親電取代的方式，在水相室溫條件下成功實現了西侖吉肽c(RGDfMeV)的一步18F標記(圖1).該標記方法對多肽結構改變較小，因此對多肽活性影響較小，但反應需要在三氟乙酸溶液中進行，不適合pH敏感的多肽18F標記.此外，該反應的化學選擇性較差，在沒有定位基團的情況下可出現多個標記產物，且比活度較低(3.28×10-2GBq/μmol)，不適用于對比活度要求較高的受體顯像.

(i)[18F]AcOF，三氟乙酸，乙腈，室溫.圖1 基于芳香環親電反應的一步18F標記多肽Fig.1One-step 18F-labeling of peptides based on aromatic ring electrophilic reaction

1.1.2 基于親核反應的一步18F標記多肽方法

(i)[18F]KF，DMSO，50 ℃，15 min[12]；(ii)[18F]KF，DMSO，130 ℃，3.5 min[13].圖2 基于親核反應的一步18F標記多肽Fig.2One-step 18F-labeling of peptides based on nucleophilic reaction

[18F]F-的芳香親核取代反應(SNAr)是直接形成C(sp2)—18F鍵常用的標記方法，前體通常包含離去基團，并在離去基團的對位或鄰位帶有活化基團(通常為強吸電子基團).Becaud等[12]以三甲基銨作為離去基團、二甲基亞砜(DMSO)為反應溶劑，在50 ℃下反應15 min，通過[18F]F-的SNAr實現了多肽的一步18F 標記(圖2(a))，經放射性高效液相色譜(radio-HPLC)測定放射化學產率(RCY)為19%～92%.Jacobson等[13]通過4-硝基-3-三氟甲基苯甲酰氯與環肽c(RGDfK)和二聚RGD肽E[c(RGDfK)]2偶聯，利用微波反應在DMSO溶劑中130 ℃下加熱反應3.5 min，實現了以硝基為離去基團的多肽一步18F標記(圖2(b))，其RCY為7%～23%.基于SNAr的一步18F標記往往需要在無水、高溫和有機溶劑等苛刻的條件下進行，因此不適用于敏感多肽的標記.

1.1.3 基于自由基反應的一步18F標記多肽方法

(i)[18F]NFSI，NaDT，乙腈，水，室溫，40 min.圖3 基于自由基反應的一步18F標記多肽Fig.3One-step 18F-labeling of peptides based on free radical reaction

2018年Yuan等[14]報道了在紫外光(365 nm)照射下，以十聚鎢酸鈉(NaDT)為催化劑、[18F]N-氟苯磺酰亞胺([18F]NFSI)為放射性氟源，進行含亮氨酸多肽的18F標記(圖3)，其RCY為16%～35%.亮氨酸殘基中的異丙基在光照及催化條件下傾向于生成穩定的三級碳自由基，在鏈轉移過程中結合[18F]NFSI中的18F 得到標記產物.該方法標記可以耐受水相介質，反應條件較溫和,區域選擇性好，其多肽中氨基、羧基等活性基團不需要提前保護，不需要借助標記輔助基團，對多肽結構改變較小;但這種標記方法只適用于含有亮氨酸的多肽，且反應時間相對較長，比活度較低(1.3×10-3～5.3×10-3GBq/μmol)，不適用于對比活度要求較高的受體顯像.

1.2 基于生成Si—18F鍵的一步標記方法

與C—F鍵的鍵能(480 kJ/mol)相比，Si—F鍵的鍵能(>570 kJ/mol)更高、更穩定，于是基于生成Si—18F鍵的標記方法引起了廣泛關注.1985年，Rosenthal等[15]將Si—18F鍵引入到標記化學中，在乙腈水溶液(V乙腈∶V水=13∶7)中，[18F]四甲基氟化銨與三甲基氯硅烷反應得到[18F]三甲基氟硅烷，經過衰減校正后產率為80%；大鼠吸入[18F]三甲基氟硅烷后，骨骼中有明顯的氟離子富集，表明[18F]三甲基氟硅烷在體內穩定性較差，該研究首次證明了在含水介質亦可形成Si—18F鍵，打開了溫和18F 標記的大門.之后，H?hne等[16-17]通過密度泛函理論建立了有機氟硅烷水解的理論模型，發現通過增加圍繞硅原子的空間位阻能提高Si—18F鍵的穩定性;以DMSO為反應溶劑、羥基或氫為離去基團，在30～90 ℃條件下經[18F]F-親核取代反應合成了含有雙功能官能團18F標記的有機氟硅烷，RCY為25%～90%，并將其進一步與蛙皮素肽偶聯，實現了多肽的18F標記.該法標記的多肽在體內外均有較好的穩定性，首次實現了基于生成Si—18F鍵的多肽18F標記，但需通過兩步實現且標記條件相對苛刻.Schirrmacher等[18]以叔丁基大位阻保護的叔丁基氟硅烷(SiFA)和奧曲肽通過肟鍵相連形成的“SiFA-多肽”作為標記前體，通過18F/19F同位素交換法在無水乙腈中室溫下反應15 min，實現了SiFA-多肽的一步18F標記(圖4)，RCY為95%～97%;但當乙腈水溶液(V乙腈∶V水=1∶4)作為反應溶劑，該反應在室溫下RCY僅為5%，而在95 ℃下RCY高達70%～90%.該方法需要過量的標記前體才能獲得較高的RCY，而標記產物無法通過化學方法與前體分離，因此比活度較低.

(i)[18F]KF，乙腈，室溫，10～15 min；(ii)[18F]KF，乙腈，水，95 ℃，30 min.圖4 基于Si—18F鍵的一步18F標記多肽Fig.4One-step 18F-labeled peptides based on Si—18F bond

Si—F鍵的水解是該結構固有的問題，但可以使用大位阻保護的方法來適當提高體內Si—18F鍵的穩定性，從而達到PET顯像的要求.總之，Si—F鍵為實現在部分水相溶劑中進行多肽的一步18F標記提供了一種可行策略.

1.3 基于生成B—18F鍵的一步標記方法

B—F鍵(鍵能>730 kJ/mol)是已知熱力學最穩定的共價鍵之一.Ting等[19]以三氟硼酸鹽為標記前體，利用同位素交換法獲得[18F]芳基三氟硼酸鹽，通過在芳基環上引入吸電子基團或利用缺電子雜環取代苯環[18F]芳基三氟硼酸鹽的其提高水解穩定性.該方法的最大優點是能夠在水相介質中進行一步18F標記，從而避免了耗時且相對復雜的氟離子共沸干燥步驟.Liu等[20]設計出一系列三氟硼酸鹽共軛物作為放射性藥物標記前體，以pH=2.0的50%(體積分數)二甲基甲酰胺(DMF)水溶液為反應溶劑，在45 ℃的條件下反應15 min(圖5)，實現了環肽c(RGD)等多肽的一步18F標記[21].

(i)[18F]KF，DMF，水，45 ℃，15 min.圖5 [18F]芳基三氟硼酸鹽標記多肽的合成路線Fig.5Synthetic route of [18F]aryl trifluoroborate labeled peptides

(i)[18F]KF，DMF，水，80 ℃，12 min.圖6 [18F]烷基氨甲基三氟硼酸鹽標記多肽的合成路線Fig.6Synthetic route of [18F]AMBF3 labeled peptides

盡管基于生成B—18F鍵的一步標記方法獲得了初步成功，但標記多肽的穩定性有限，在體外仍會緩慢水解(脫氟).Liu等[21]用烷基氨甲基三氟硼酸鹽(AMBF3)基團代替芳基三氟硼酸鹽，改善了B—F鍵的體內穩定性并優化了反應條件.以AMBF3修飾的奧曲肽為前體，利用無載體添加的[18F]KF在pH=2.0的DMF/水溶液中加熱80 ℃反應12 min，通過18F/19F同位素交換法實現了多肽的18F標記(圖6)，經C18柱純化后RCY為20%～25%，比活度為111 GBq/μmol，且[18F]AMBF3標記的奧曲肽在體外和體內實驗中均顯示出較高穩定性，具有廣闊的應用前景.

1.4 基于生成Al—18F鍵的一步標記法

氟離子可以與眾多金屬陽離子形成較強的配位鍵，與Al3+的相互作用(>670 kJ/mol)比大多數金屬強.在水相條件下，金屬氟化物能與螯合基團配位，因此有望利用[18F]AlF2+與螯合基團修飾的多肽螯合，實現多肽的一步18F標記(圖7).

圖7 放射性合成含[18F]AlF2+-多肽偶聯物的一般方法Fig.7General methodology for the radiosynthesis of [18F]AlF2+-peptides conjugates

利用這種標記策略，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)-、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)-、S-2-(4-異硫氰酸根合芐基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(p-SCN-Bn-NOTA)-、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4-二乙酸酯(NODA)-和(±)H3RESCA-肽綴合物(圖8)均通過與[18F]AlF2+配位進行了放射性標記.

圖8 常用的[18F]AlF2+螯合基團Fig.8Commonly used [18F]AlF2+ chelating groups

[18F]AlF2+-DTPA-多肽在血清中表現出較差的穩定性(脫氟)，而[18F]AlF2+-NOTA-多肽在37 ℃的血清中4 h內表現出較好的體外穩定性.[18F]AlF2+-NOTA-多肽在LS174T荷瘤裸鼠體內也表現出較好的穩定性.此外，在注射放射性藥物30 min后分析裸鼠的尿液，結果表明[18F]AlF2+-NOTA-肽綴合物主要以原藥形式存在，這種穩定性的差別是由于[18F]AlF2+-NOTA的結構剛性明顯強于[18F]AlF2+-DTPA;在NOTA結構的基礎上通過在大環上修飾芐基，得到S-2-(4-異硫氰酸根合芐基)-1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸，可阻止NOTA和[18F]AlF2+螯合后結構的翻轉，一定程度上增加了結構剛性，從而使得絡合物的水解常數降低一個數量級,并阻止了螯合基團與其他競爭性金屬離子的絡合[22].Mcbride等[23]通過p-SCN-Bn-NOTA與多肽偶聯得到IMP449(NOTA-p-Bn-CS-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)，以pH=4.0的乙酸鈉緩沖液為溶劑,在100 ℃條件下反應15 min獲得Al18F-IMP449.pH值對AlF2+-螯合物的合成極為重要，高pH值會形成不溶性氫氧化鋁，低pH值則會導致[18F]F-質子化而阻止氟離子與鋁原子配位，最佳的pH值約為4.0.[18F]AlF2+-NOTA-多肽與[18F]AlF2+-NODA-多肽的合成大致相同，但在相同條件下[18F]AlF2+-NODA-多肽的RCY更高.2012年，Mcbride等[24]實現了NODA-甲基苯基乙酸(MPAA)-di-HSG(組胺-琥珀酰-甘氨酸)半抗原肽的標記試劑盒化，以乙醇/生理鹽水(體積比1∶1)為溶劑，在108 ℃下反應15 min后用Alumina N柱純化，標記產物的RCY為45.6%.

基于生成Al—18F鍵的多肽一步標記方法取得了較大的進展，并逐漸試劑盒化.美中不足的是，鋁螯合步驟需要在高溫條件下(100 ℃)進行，不利于對溫度敏感的多肽標記.Cleeren等[25]以(±)H3RESCA作為[18F]AlF2+的新型螯合基團，通過適當減小螯合基團的結構剛性優化[18F]AlF2+與配體螯合的標記條件，在室溫下反應35 min內實現了人血清白蛋白、NbV4m119、納米抗體等生物分子的18F一步標記和純化，且獲得了較滿意的RCY(35%～63%).

1.5 基于P—18F鍵的一步標記法

P—F鍵的鍵能(490 kJ/mol)與C—F鍵的相近，因此在體內外可能具有較好的穩定性.此外，氟化碳、氟化硼和氟化硅和氟化磷的自由基生成熱能分別為(255.0±8.4)kJ/mol、(-115.8±13.8)kJ/mol、(-20.1±12.5)kJ/mol和(-52.3±20.9)kJ/mol，說明磷氟化物、硅氟化物、硼氟化物比碳氟化物更容易形成.Studenov等[26]首次利用磷酰氯和[18F]F-在室溫條件下通過SNAr將P—18F鍵引入18F標記化學中，反應5 min后，其RCY可達96%(圖9(a));但該化合物在體外的穩定性較差，在水溶液中30 min便出現明顯分解(脫氟).Vabre等[27]以N-雜環卡賓-王氟化磷([18F]NHC-PF5)為標記前體，在路易斯酸SnCl4催化的條件下，通過18F/19F同位素交換法與[18F]F-在60 ℃反應10 min，成功標記了[18F]NHC-PF5(圖9(b))，但RCY僅為4%～6%.雖然[18F]NHC-PF5在體內外具有較好的穩定性，但是該標記方法的RCY太低，不適合臨床應用.2019年，Hong等[28]設計了以氟代氧化膦(DBPOF)作為氟受體的18F標記方法，通過大位阻保護策略提高P—F鍵在體內外的穩定性,將DBPOF與生物分子如c(RGDyK)和人血清白蛋白(HAS)偶聯后，首次在室溫、中性純水相的條件下，通過18F/19F同位素交換法實現了溫和的多肽一步18F標記(圖9(c))，RCY高達(50±5)%.該標記方法解決了對溶劑、溫度、pH敏感的多肽一步18F標記，但由于標記采取同位素交換法，其比活度較低(0.22～0.37 GBq/μmol)，往往需要使用較高比活度的[18F]F-才能滿足受體成像要求(37 GBq/μmol).

(i)[18F]KF，乙腈，室溫，5 min[26]；(ii)[18F]四丁基氯化銨(TBAF)，SnCl4，60 ℃，10 min[27]；(iii)[18F]KF，水，DMSO，室溫，25 min[28].圖9 基于P—18F鍵多肽的一步18F標記Fig.9One-step 18F-labeling of peptides based on P—18F bond

2 多步18F標記多肽策略

多步18F標記多肽方法通常先對結構相對簡單的標記輔助基團進行18F標記，再在溫和條件下與多肽進行偶聯，利用HPLC或固相萃取(SPE)分離未標記的多肽和副產物，使得18F標記的多肽具有較高的放射化學純度和比活度.

已開發的此種標記輔助基團大致可分為5類：1) 以羧基活化酯為基礎的胺反應性標記輔助基團,2) 以醛基為基礎的氨氧基或聯氨基反應性標記輔助基團,3) 以馬來酰亞胺或六氟苯為基礎的巰基反應性標記輔助基團,4) 通過“點擊化學”實現疊氮或炔基修飾多肽的18F標記輔助基團,5) 基于三氟甲基化的多肽18F標記輔助基團.多步18F標記方法可避免將多肽直接暴露于苛刻的標記條件下，實現了多肽的溫和標記.

2.1 基于胺反應性標記輔助基團的多步標記方法

羧基活化酯主要有4-硝基苯基2-[18F]氟丙酸酯([18F]NFP)、2,4-二硝基苯基2-[18F]氟丙酸酯、[18F]2,3,5,6-四氟苯基6-氟煙酸酯([18F]F-Py-TFP)、[18F]氟苯甲酸酯-琥珀酰亞胺基([18F]SFB)、[18F]N-琥珀酰亞胺基4-氟甲基苯甲酸酯([18F]SFMB)和[18F]N-琥珀酰亞胺8-[(4′-氟芐基)氨基]辛酸酯(SFBS)等(圖10)可用于多肽偶聯.2,4-二硝基苯基2-[18F] 氟丙酸酯因易爆炸而較少使用[29-30]，胺反應性羧基活化酯標記輔助基團以[18F]NFP、[18F]SFB、[18F]F-Py-TFP為主，廣泛應用于18F標記多肽的合成.

圖10 活化羧基18F標記輔助基因結構Fig.10Auxiliary group structure of 18F-labeled activated esters

Haubner等[31]利用[18F]NFP以DMSO為反應溶劑在70 ℃下與c(RGD-D18F]NFP偶聯，RCY約為50%.與[18F]NFP相比，輔基[18F]SFB的特征是芳香族[18F]氟苯甲?；鶜埢?，[18F]SFB優先與肽主鏈中存在的伯胺偶聯.Vaidyanathan等[32]于1992年首次報道了[18F]SFB的合成，即以三甲酸酯4-甲?；?N，N，N-三甲基苯胺為標記前體進行18F標記，再氧化形成4-[18F]氟苯甲酸，隨后在縮合劑二環己基碳二亞胺(DCC)存在條件下，與N-羥基琥珀酰亞胺反應生成[18F]SFB，總合成時間為100 min，RCY約為25%.Thonon等[33]通過[18F]SFB實現了PEG-E[c(RGDyK)]2的自動化合成，總合成時間約為130 min，RCY為(13±3)%，經純化后放射化學純度達98%以上，比活度為(140±40) GBq/μmol.Kapty等[34]利用[18F]SFB以混合溶液(V乙腈∶V柯耳蜀夫緩沖液=1∶3，pH=8.4)為反應液，在40 ℃的條件下反應40 min，實現了[18F]SFB與LIKKPF多肽的偶聯，RCY約為75%.[18F]SFB是目前最重要且常用的18F標記多肽的標記輔助基團.

Basuli等[30]通過N，N，N-三甲基-5-((2,3,5,6-四氟苯氧基)羰基)吡啶-2-銨三氟甲磺酸鹽的[18F]TBAF親核取代，在40 ℃下攪拌10 min獲得[18F]F-Py-TFP，RCY為(50±10)%；以磷酸鹽緩沖液(pH=9.0)為反應溶劑，在40 ℃下反應15 min實現了[18F]F-Py-TFP與HSA偶聯，RCY高達97%.

基于羧基活化酯標記輔助基團的多步18F標記多肽的反應條件比較溫和，偶聯過程可在水相室溫條件下進行，但反應步驟過多且總RCY較低.近年來，隨著標記輔助基團總RCY的明顯提高和多肽標記步驟的逐漸簡化，該方法有望廣泛應用于多肽溫和標記.

2.2 基于醛基輔助基團的多步標記方法

醛基與氨氧基和聯氨基具有較高的反應活性，因此含醛基的標記輔助基團可用于氨氧基和聯氨基修飾多肽的18F標記，其中[18F]對氟苯甲醛([18F]FBA)和[18F]氟代脫氧葡萄糖([18F]FDG)應用最廣泛.

(i)[18F]F-，DMSO，60 ℃，15 min；(ii)三氟乙酸，甲醇，水，60 ℃，15 min.圖11 [18F]FB-CHO標記多肽的合成路線Fig.11Synthetic route of [18F]FB-CHO labeled peptides

Poethko等[35]以[18F]對氟苯甲醛為標記輔助基團在混合溶液(V甲醇∶V水=4∶1)中通過三氟乙酸調節pH至2.5，反應15 min實現了氨基氧乙酸修飾的小胃泌素、RGD和奧曲肽的18F標記(圖11).該標記方法對pH、溫度和多肽濃度有明顯的依賴性,60 ℃下反應15 min且多肽濃度大于0.5 mmol/L為最佳標記條件，RCY可達80%以上.

Hultsch等[36]利用[18F]FDG在130 ℃、pH=2.5條件下實現了與氨氧基修飾的c(RGD)偶聯(圖12)，RCY為56%～93%.另外，除了[18F]FDG獲取相對容易、標記步驟簡單外，多肽與[18F]FDG偶聯后有利于增強多肽的水溶性，可改善其體內的藥代動力學特征[37].

(i)[18F]FDG，三氟乙酸，DMSO，水，130 ℃，20 min.圖12 [18F]FDG標記多肽的合成路線Fig.12Synthetic route of [18F]FDG labeled peptides

基于醛基輔助基團的多步法對多肽進行18F標記，其反應選擇性高，副反應較少，但需要對多肽進行氨氧基或聯氨基提前修飾，并且反應具有pH依賴性，需在酸性溶液(pH=2.5)中進行，不適用于對酸敏感的多肽標記.

2.3 基于巰基反應性標記輔助基團的多步標記方法

巰基-邁克爾加成反應具有反應條件溫和、反應迅速、化學選擇性高等優勢，因此研究者開發了一系列基于馬來酰亞胺的巰基反應性標記輔助基團的18F標記，如N-[6-(4-[18F]氟-亞芐基)氨基氧基己基]馬來酰亞胺([18F]FBAM)、N-[2-(4-[18F]氟苯甲酰胺基)乙基]馬來酰亞胺([18F]FBEM)和[18F]FDG-馬來酰亞胺己基肟([18F]FDG-MHO)等，以解決多肽的化學選擇性標記.

Berndt等[38]利用[18F]對氟苯甲醛與N-(6-氨基羥己基)馬來酰亞胺反應得到[18F]FBAM(圖13)，RCY約為29%.將[18F]FBAM溶解在少量乙醇中，加入含有還原型谷胱甘肽(GSH，質量濃度為0.01～1.0 mg/mL)或低密度脂蛋白(質量濃度為1.006～1.063 mg/mL)的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2)中，在室溫條件下反應20 min，RCY大于95%.

(i)[18F]F-，DMF，120 ℃，15 min；(ii)MeOH, HCl,50 ℃,15 min；(iii)GSH，PBS，20 ℃，5 min.圖13[18F]FBAM合成子的合成路線Fig.13Synthetic route of [18F]FBAM synthon

(i)[18F]KF，乙腈，90 ℃，20 min；(ii)NaOH，乙腈，120 ℃，3 min；(iii)HSTU，乙腈，120 ℃，5 min；(iv)N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，DIPEA，乙腈，40 ℃，20 min；(v)[18F]KF，乙腈，120 ℃，10 min；(vi)三氟乙酸，PBS，20 ℃，10 min；(vii)N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，氰基膦酸二乙酯，二異丙基乙胺，乙腈，75 ℃，7 min.圖14 [18F]FBEM合成子的合成路線Fig.14Synthetic route of [18F]FBEM synthon

Cai等[39]通過[18F]SFB與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺偶聯獲得[18F]FBEM(圖14(a))，反應總時間為(150±20) min，RCY為(5±2)%，比活度為150～200 GBq/μmol.在三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP·HCl)存在的條件下，[18F]FBEM與巰基-RGD在PBS中室溫下孵育20 min，經HPLC純化后獲得[18F]FBEM-SRGD，未經衰減校正的RCY約為80%.[18F]FBEM合成步驟過多，反應時間過長且產率較低，不適合臨床研究應用.Kiesewetter等[40]改進了合成方法，經三步反應獲得[18F]FBEM，提高了RCY，縮短了反應時間.該反應以五甲基芐基4-(N，N，N-三甲基銨)苯甲酸酯三氟甲磺酸鹽為標記前體，通過[18F]F-親核取代反應獲得五甲基芐基4-[18F]氟苯甲酸酯，將其在酸性條件下水解得4-[18F]氟苯甲酸，最后在二乙基氰基磷酸酯和二異丙基乙胺存在條件下4-[18F]氟苯甲酸與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺偶聯(圖14(b))，經過HPLC分離純化后，在約95 min內獲得[18F]FBEM，RCY為(17.3±7.1)%.

Wuest等[41]利用[18F]FDG標記蛋白和多肽，在100 ℃加熱15 min條件下將[18F]FDG轉化為[18F]FDG-馬來酰亞胺己基肟([18F]FDG-MHO)，經HPLC純化后RCY為45%～69%.以PBS為反應溶劑在20 ℃ 條件下反應10 min，實現[18F]FDG-MHO與GSH和anxA5偶聯(圖15)，RCY約為92%.

(i)[18F]FDG，乙醇，水，100 ℃，15 min；(ii)GSH，PBS，20 ℃，10 min.圖15 [18F]FDG-MHO標記多肽的合成路線Fig.15Synthetic route of [18F]FDG-MHO labeled peptides

2013年,Spokoyny等[42]報道了以六氟苯(HFB)釘合肽/小蛋白的策略,即HFB通過1,4-二取代與巰基反應.2015年,Jacobson等[43]利用該方法通過兩步法實現了生物分子的18F標記,在室溫下以DMSO為反應溶劑,使用[18F]F-通過氟交換以(25±3)%的RCY制備得[18F]HFB.以DMF為反應溶劑在過量的三羥甲基氨基甲烷(TRIS,24當量)和過量的還原劑三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽，2.5當量)條件下，1當量的[18/19F]HFB與2當量的硫醇化c(RGDfK)在室溫下反應20～25 min實現偶聯(圖16)，RCY為(40±2)%.HFB與生物分子的釘合具有較好的選擇性且產物較為穩定，此外不需要對生物分子進行提前修飾和保護.

(i)[18F]F-，DMSO，室溫，15 min；(ii)TRIS，TCEP，DMF，20 ℃，20～25 min.圖16[18F]HFB標記多肽的合成路線Fig.16Synthetic route of [18F]HFB labeled peptides

基于巰基反應性標記輔助基團的多肽多步18F標記反應條件溫和，可在中性或偏堿性(pH=7.0～8.0)水溶液中進行,化學選擇性較好,多肽用量少,偶聯效率高，并且天然的多肽和蛋白中往往含有半胱氨酸殘基，通常不需要對多肽和蛋白進行基團修飾.然而，基于馬來酰亞胺的巰基反應性標記輔助基團與多肽偶聯時，由于存在競爭性的反邁克爾加成和巰基交換反應，其偶聯產物在體內或含有巰基的體系中穩定性有限，限制了該方法的應用.

2.4 基于“點擊化學”的多步標記方法

“點擊化學”是2001年由Sharpless引入的概念，即通過1,3-偶極Huisgen環加成反應，其特征是通過炔烴與疊氮化物利用Cu(Ⅰ)催化反應形成三唑[44].在過去的10年中，“點擊化學”已成為放射性藥物化學中一個強大合成方法[45-46].最初Cu(Ⅰ)催化劑是通過CuSO4(Ⅱ)原位還原生成，后來直接使用Cu(Ⅰ)鹽，如CuI或CuBr.該反應具有在水相中反應快速、化學和區域選擇性高等優勢,已廣泛應用于多肽的放射性標記.2006年，Marik等[47]在放射性藥物領域率先提出了這一反應，通過ω-[18F]氟炔烴與疊氮丙酸修飾的模型肽，在10 min內以55%～99%的RCY實現了Cu(Ⅰ)介導的“點擊化學”反應[46].2011年，Gill等[48]設計和合成了[18F]F-PEG3-疊氮化物，以Cu(Ⅰ)作為催化劑、雙菲咯啉二磺酸鹽(BPDS)作為亞銅螯合配體，在60 ℃條件下與炔基修飾多肽反應10 min,實現了炔基修飾多肽與[18F]F-PEG3-疊氮化物的偶聯(圖17)，且RCY為(62±4)%.與ω-[18F]氟炔烴相比,18F-PEG3-疊氮化物不易揮發,有利于產物的后處理，并且通過PEG修飾后可改善多肽的藥代動力學特征，有利于體內成像研究.

(i)[18F]F-，TBAHCO3，乙腈，100 ℃，10 min；(ii) 炔基修飾的多肽，CuSO4，BPDS，抗壞血酸鈉，100 ℃，10 min.圖17 [18F]F-PEG3-疊氮化物標記多肽的合成路線Fig.17Synthetic route of [18F]F-PEG3-azide labeled peptides

2009年，Maschauer等[49]以1,3,4,6-四-O-乙?；?2-O-三氟甲基磺?；?β-D-甘露吡喃糖基疊氮化物為標記前體,在85 ℃下與[18F]F-反應15 min后，通過NaOH脫保護得到[18F]2-脫氧-2-氟-甘露吡喃糖基疊氮化物，RCY為(71±10)%.以CuSO4作為銅源、抗壞血酸鈉作為還原劑、水和叔丁醇的混合溶液作為反應液，在60 ℃下[18F]2-脫氧-2-氟-β-D-甘露吡喃糖基疊氮化物與炔基修飾的多肽反應10 min，實現了[18F]2-脫氧-2-氟-β-D-甘露吡喃糖基疊氮化物與炔基修飾多肽的偶聯(圖18)，RCY>90%.由于甘露糖具有較好的親水性，因此多肽與[18F]2-脫氧-2-氟-β-D-甘露吡喃糖基疊氮化物偶聯后有利于增強多肽的水溶性，可改善其體內的藥代動力學特征.

(i)1) [18F]F-，乙腈，85 ℃，15 min,2) NaOH，60 ℃，55 min;(ii) 炔基修飾的多肽，CuSO4，抗壞血酸鈉，60 ℃，10 min.圖18 [18F]2-脫氧-2-氟-β-D-甘露吡喃糖基疊氮化物標記多肽的合成路線Fig.18Synthetic route of [18F]2-deoxy-2-fluoro-β-D-glucopyranosyl azide labeled peptides

Ramenda等[50]通過引入芳香族18F標記的炔烴，解決了18F標記的脂肪族炔烴在體內穩定性較低的問題.Thonon等[51]開發了1-(疊氮甲基)-4-[18F]氟苯作為標記輔助基團用于多肽的18F標記，其在體內具有較高的穩定性;以炔烴修飾的[Leu5]腦啡肽為模型肽，在室溫下15 min內以95%的RCY合成了18F標記的三唑肽衍生物(圖19).

然而上述點擊化學反應需要以Cu(Ⅰ)作為催化劑，但Cu(Ⅰ)離子通常具有細胞毒性，在體內可通過形成羥基自由基導致DNA分子和蛋白質的氧化降解，限制了該方法的實用性.為此研究者們開發了通過疊氮化物與環辛炔的彎曲三鍵反應,以及四嗪與反式環辛烯的逆電子需求的Diels-Alder反應，實現了無銅催化的“點擊化學”反應.2011年，Arumugam等[52]利用[18F]氮雜二苯并環辛炔([18F]ADIBO)通過無銅催化的疊氮化物-炔烴[3+2]-偶極環加成，以乙腈水溶液為反應溶劑，在室溫條件下反應5～10 min,實現了疊氮修飾的多肽標記(圖20)，RCY>90%.Carpenter等[53]通過上述方法，在生理條件下以幾乎定量的RCY，通過[18F]疊氮化物合成子實現了ADIBO修飾的肽的18F標記.在該研究中使用一種獨特的含疊氮化物清除劑樹脂代替HPLC純化，有效地從所需的放射性標記的三唑產物中除去了未反應的ADIBO肽前體，使得該方法易于實現臨床轉化.

(i)[18F]F-，DMSO，130 ℃，5 min；(ii)NaBH4，水，室溫；(iii)48%(質量分數)HBr水溶液，室溫；(iv)疊氮化物交換樹脂，DMF，室溫，15 min；(v)CuI，DMF，室溫，15 min.圖19 1-(疊氮甲基)-4-[18F]氟苯標記多肽的合成路線Fig.19Synthetic route of 1-(azidomethyl)-4-[18F] fluorobenzene labeled peptides

2014年，Liu等[54]利用四嗪基-馬來酰亞胺(TM)，以85%的RCY與環肽c(RGDyC)綴合得到四嗪基-馬來酰亞胺-RGD共軛物(TM-RGD)，在40 ℃條件下以DMSO為反應溶劑，使用極少量的TM-RGD (80～100 μmol/L)與反式-環辛烯([18F]TCO)共孵育5 min，實現了多肽的18F標記(圖21)，RCY>95%.該方法具有化學選擇性好、反應速度快、偶聯產率高、多肽量少、無催化劑等優勢.

(i)[18F]F-，乙腈，100 ℃，5～10 min；(ii) 乙腈，水，室溫，20～25 min.圖20 [18F]ADIBO標記多肽的合成路線Fig.20Synthetic route of [18F]ADIBO labeled peptides

(i)[18F]TBAF，乙腈，75 ℃，15 min；(ii) DMSO，40 ℃，5 min.圖21 [18F]TCO標記多肽的合成路線Fig.21Synthetic route of [18F]TCO labeled peptides

2.5 基于三氟甲基化反應的多步標記方法

基于三氟甲基化的多肽多步18F標記，主要通過合成18F標記的三氟甲基化試劑，再用于標記多肽.2018年，Verhoog等[55]以[1,1′-聯苯]-4-基(溴二氟甲基)-硫烷為標記前體，在三氟甲烷磺酸銀(AgOTf)存在下與[18F]F-通過鹵素交換獲得[18F][1,1′-聯苯]-2-基(三氟甲基)硫烷，進而在三氟甲磺酸酐存在下經間氯過氧苯甲酸(mCPBA)氧化成環，得到18F標記的三氟甲基化試劑[18F]5-(三氟甲基)二苯并噻吩三氟甲磺酸鹽(圖22)，利用(三氟甲基)二苯并噻吩三氟甲磺酸鹽提供的堿性條件，在半胱氨酸殘基位點實現了多肽的三氟甲基化，該方法的RCY為(19±5)%.

2020年，Kee等[56]報道了以2,2-二氟-2-(三苯基膦酸)乙酸酯(PDFA)和N-甲基嗎啉·二氧化硫(NMM·SO2)為原料，與[18F]F-反應得到18F標記的三氟甲基化試劑[18F]三氟甲烷亞磺酸銨(圖23).以叔丁基過氧化氫(TBHP)作為氧化劑，在Fe(NO3)3存在條件下，[18F]三氟甲烷亞磺酸銨與含有色氨酸和(或)酪氨酸殘基的模型肽在HCO2NH4/DMSO混合溶液中反應20 min，實現了多肽的[18F]三氟甲基化，RCY為14%～29%.

(i)[18F]F-，AgOTf，二氯甲烷，60 ℃，20 min；(ii) 間氯過氧苯甲酸，三氟甲磺酸酐，二氯甲烷，45 ℃，20 min；(iii) Et4NHCO3，DMSO/H2O, 40 ℃，20 min.圖22 [18F]5-(三氟甲基)二苯并噻吩三氟甲磺酸鹽標記多肽的合成路線Fig.22Synthetic route of [18F]5-(trifluoromethyl) dibenzothiophenium trifluoromethanesulfonate labeled peptides

基于三氟甲基化的多肽多步18F標記具有標記條件溫和、化學選擇性高、對多肽結構改變小等優勢，但18F標記的三氟甲基化試劑制備過程較為復雜且總RCY較低，不適合臨床應用.

(i)[18F]F-，PDFA，NMM·SO2，DMF，100 ℃，20 min；(ii)TBHP，Fe(NO3)3，HCO2NH4/DMSO，40 ℃，20 min.圖23 [18F]三氟甲烷亞磺酸銨標記多肽的合成路線Fig.23Synthetic route of [18F]trifluoromethanesulfinate labeled peptides

3 固相18F標記多肽策略

在固相18F標記策略中，2-氟丙酸([18F]FPA)和[18F]對氟苯甲酸([18F]FBA)是最常用的標記輔助基團.2006年，Marik等[57]以[18F]FPA為標記輔助基團，在活化劑2-(7-氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)提供的堿性條件下反應30 min，實現了[18F]FPA與肽基樹脂偶聯(圖24(a))，RCY約為10%.2002年，Sutcliffe-Goulden等[58]利用5-((9H-黃原-2-基)氧基)戊酸將線性多肽組裝在固相聚乙二醇-聚苯乙烯載體上，在HATU和DIPEA存在的條件下2 min內實現了[18F]FBA與多肽(以KPQVTRGDVFTEG-NH2為例)的偶聯，并在三氟乙酸、苯酚、水、三異丙基硅烷的混合溶液中裂解得到[18F]FBA-KPQVTRGDVFTEG-NH2(圖24(b))，RCY為80%～90%，未經HPLC純化的粗產物的放射化學純度>95%.2016年，Davis等[59]利用[18F]FBA作為標記輔助基團，實現了以c(RGDyK) 為例的環肽固相標記，通過多肽固相合成法實現了c(RGDyK) 從頭到尾環化，在HATU和DIPEA存在的條件下將[18F]FBA與肽基樹脂反應并偶聯到多肽上，再通過三氟乙酸-三異丙基硅烷(TFA-TIPS)混合溶液裂解和脫保護獲得cRGDyK([18F]FBA)(圖24(c))，RCY為(14±2)%.

(i)[18F]F-，乙腈，100 ℃，15 min；(ii)三乙胺，DMF，水，100 ℃，10 min；(iii) 1) HATU，DPIEA，DMF，30 ℃，30 min，2) TFA；(iv)[18F]F-，DMF，90 ℃，3 min；(v)NaOH，90 ℃，3 min；(vi) 1) HATU,DPIEA,DMF, 2) TFA,TIPS.圖24 固相18F標記多肽的合成路線Fig.24Synthetic route of solid-phase 18F-labeled peptides

4 總結與展望

PET技術可無創地實現活體生理、病理、生化過程的實時監測，是目前影像學的前沿技術之一.與近年來我國PET中心的迅速增加相比，18F標記的放射性藥物的臨床應用顯得滯后，正電子發射探針的缺乏限制了我國PET的進一步發展.多肽由于其優異的靶向性、代謝性質和安全性可作為分子探針先導化合物.多肽對環境的敏感為其18F標記帶來了一定挑戰，但同時促進了多肽18F標記方法的發展.以碳原子作為氟受體核心的一步18F標記方法一般具有反應時間短、操作簡單、易于實現自動化生產等優勢，但標記條件相對苛刻，不適用于對強酸、強堿、高溫、有機溶劑等敏感的多肽18F標記.以雜原子(B、Al、Si和P)作為氟受體核心原子的一步18F標記方法，其條件比以碳原子為核心的一步18F標記方法要溫和得多，因而近年來逐漸興起；但其18F標記產物在體內容易出現脫氟現象，故需要引入多種策略(如引入吸電子基團、使用缺電子雜環、增強螯合基團結構剛性和引入大位阻基團等)以增強其體內穩定性.目前多肽的18F標記仍主要采用多步法標記策略，其滿足在水相、中性、室溫等溫和的標記條件下標記多肽，但反應步驟多、時間長、總RCY低等缺點限制了其臨床應用.固相標記法具有標記條件溫和、區域選擇性好等優勢，但需要對多肽保護和脫保護，且環肽標記較復雜，因此固相標記法往往適用于直鏈短肽的18F標記.

綜上，18F標記多肽的方法眾多，但各有優缺點，因此需要研究者根據多肽性質、PET要求等，結合不同方法的優缺點選擇合適的標記方法.對于新型標記方法的研究，探尋RCY高(一般要求>25%)、比活度高(一般要求>37 GBq/μmol)、區域選擇性好、標記過程簡單(盡可能一步標記)、標記條件溫和的理想多肽18F標記方法仍具有重大意義和廣闊前景.