滇產5種植物精油的抑菌性能及其成分分析

閆佳,牛延菲,史正軍,雷福厚,趙平,吳春華,*

(1. 西南林業大學化學與工程學院，昆明 650224；2. 廣西民族大學，廣西林產化學與工程重點實驗室，南寧 530006)

植物精油是植物次生代謝產物，是具有揮發性的一類油狀液體。其成分多達100余種，包括醇類、醛類、酚類、丙酮類、萜烯類和酸類等，可隨水蒸氣蒸出[1]。研究表明，多數天然源植物揮發油具有殺菌、防腐、防蟲等生物活性[2-3]。互葉白千層油可有效抑制灰霉病菌和大腸桿菌的生長[4-5],迷迭香油可作為殺菌劑有效抑制黃曲霉的活性[6],桉葉油對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、枯草芽孢桿菌等真菌抑制效果較好[7],丁香、肉桂精油能有效地抑制大米中青霉和黑曲霉的生長[8]。由于植物精油具有廣譜抑菌活性、對人畜毒性小和不污染環境等優點，越來越多的植物精油受到人們的關注，可被廣泛應用于化妝品、食品、飼料和醫療衛生等領域。

食源性微生物不僅造成食物的腐敗變質，甚至會引起食物中毒，威脅到我們的生命。其中，霉菌在生活中十分常見，霉菌毒素是霉菌次生代謝產物，廣泛分布在大米、小麥和深加工食品中[9]。當被人體誤食或被皮膚吸收后，霉菌毒素常會引起機能減退、疾病乃至死亡。大多數產毒霉菌屬于青霉菌屬、曲霉菌屬、鐮孢霉菌[10]。

本研究以云南5種常見的植物資源為研究對象，用其揮發油針對主要食源性微生物進行抑菌活性研究，并通過氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)分析其抑菌的主要活性成分，以期為云南豐富的植物資源利用和發展天然健康的食品抑菌劑提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

冬青(IlexchinensisSims)油、藍桉(EucalyptusglobulusLabill.)油、互葉白千層(Melaleucaalternifolia)油由云南森美達生物科技有限公司提供，均采用水蒸氣蒸餾提取。5年生迷迭香(Rosmarinusofficinalis)采自西南林業大學樹木園，3年生香葉天竺葵(Pelargoniumgraveolens)采自中國林業科學研究院資源昆蟲研究所種植大棚。

綠木霉(Trichodermaviride)、黑曲霉(Aspergillusniger)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

水楊酸甲酯、二甲基亞砜、蔗糖和無水硫酸鈉均為分析純，瓊脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，馬鈴薯(市售)。

1.2 試驗儀器

超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，恒溫培養箱(寧波東南儀器有限公司)，高壓滅菌鍋(華粵行儀器有限公司)，冷藏箱(浙江華美電器制造有限公司)，氣相色譜-質譜聯用儀(7890A-5975C美國安捷倫公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物精油的提取

選取供試植物葉片5 kg作為樣品，洗去泥灰，剪碎成碎片備用。將樣品置于水蒸氣蒸餾裝置中按常規水蒸氣蒸餾法提取3 h，靜置分層，取上層揮發油，加入無水硫酸鈉干燥，得到精油產品，密封避光冷藏保存。

1.3.2 5種植物精油抑菌活性的測定

供試菌懸液的制備參照王安可等[10]的方法略加改進，將綠木霉、黑曲霉和桔青霉分別接種至直徑90 mm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上，暗培養(28 ℃)，7 d后用無菌環挑取培養基表面的菌體放入研缽中，加生理鹽水研磨至肉眼觀察無塊狀，然后經無菌棉球過濾至三角瓶中，制備成菌懸液。血球計數板計數，用無菌生理鹽水分別將3種菌的懸濁液稀釋至濃度為1×106個/mL，在4 ℃冷藏箱保存備用。

抑菌活性的測定采用濾紙片法[11]，吸取3種菌懸液各200 μL移至PDA培養基上，用滅菌后的涂布棒涂布均勻，將培養基平均分為4個區間，每個區間分別放入直徑為6 mm的滅菌濾紙片，其中3個濾紙片上分別注入5 μL植物精油，空白對照則注入5 μL蒸餾水，然后將培養皿用保鮮膜包好倒置放入28 ℃的恒溫培養箱中，3 d后開始用十字交叉法測量抑菌圈直徑[12]， 3次平行試驗。

1.3.3 5種植物精油的最小抑菌濃度測定

參考牛彪等[13]的方法并稍加改變，用二甲基亞砜(DMSO)助溶，按照精油與DMSO體積比為1∶9分別將5種植物精油溶解，用蒸餾水將溶解的精油稀釋成體積濃度為0.06，0.13，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 μL/mL的溶液，與未凝固PDA培養基充分混勻后倒入培養皿中，待凝固后用移液槍吸取200 μL的菌懸液于培養基上，用三角棒涂布均勻，最后用保鮮膜包好放入28 ℃恒溫培養箱培養。2 d后觀察并記錄培養基的情況，從而得出5種植物精油抑制綠木霉、黑曲霉和桔青霉的最小抑菌濃度。

1.3.4 5種植物精油的成分分析

植物精油的成分分析使用氣相色譜-質譜聯用儀，并參照董麗華等[14]的檢測方法。色譜柱為Agilent DB-17MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，色譜條件：程序升溫(初始溫度為70 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持2 min，以 10 ℃/min升至220 ℃保持10 min)，載氣為高純氦氣，恒流模式，柱流量1 mL/min，平均線速度37 cm/s，進樣量1 μL，進樣口溫度230 ℃，分流比50∶1。質譜條件：EI電離模式，電子倍增管電壓1 913.0 V，電子能量70.0 eV，離子傳輸管溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描質量范圍30～550 m/z。

2 結果與分析

2.1 5種植物精油對3種霉菌的抑菌活性

5種植物精油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌活性試驗結果見圖1。

圖1 5種植物精油對3種霉菌的抑菌活性Fig. 1 The antifungal activity of five plant essential oils against three molds

由圖1a可知，前4天5種植物精油對綠木霉的抑菌活性關系為：冬青油=香葉天竺葵油>互葉白千層油>迷迭香油>藍桉油，冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性保持不變，其他3種均呈現下降的趨勢。從第5天開始冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性也呈現下降的趨勢，冬青油下降得更為劇烈，但抑菌活性明顯大于其他3種精油；藍桉油和迷迭香油的抑菌活性持續性較差，到第6天、第7天已無抑菌效果；互葉白千層油的抑菌效果中等，但其抑菌活性的持續性較好。

由圖1b可知，香葉天竺葵油對黑曲霉的抑菌效果最好，其次是冬青油，迷迭香油和互葉白千層油，藍桉油的最差，幾乎沒有抑菌效果。前4天香葉天竺葵油和冬青油對黑曲霉具有同等的抑菌效果，從第5天開始冬青油和香葉天竺葵油的抑菌活性急劇下降。互葉白千層油和迷迭香油的抑菌效果持續性較好。

由圖1c可知，5種植物精油對桔青霉有不同的抑菌作用，香葉天竺葵油和冬青油的抑菌效果最好，其次是互葉白千層油，迷迭香油和藍桉油的抑菌效果相當，且持續性較好。

5種植物精油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉3 d后的抑菌活性效果見圖2。

圖2 5種植物精油對3種霉菌3 d后的抑菌活性效果Fig. 2 Antifungal activity of five plant essential oils against three molds after 3 days

由圖2可知，冬青油和香葉天竺葵油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果較強，培養皿內均無菌生長，這是由于精油植物揮發到整個培養皿中。藍桉油對黑曲霉的抑菌圈直徑為0 mm，對綠木霉的抑菌效果也較弱。迷迭香油對3種霉菌的抑菌圈直徑較小，表明抑菌活性相對較弱。互葉白千層油的抑菌效果比冬青油和香葉天竺葵油差，但比迷迭香油和藍桉油好。

2.2 5種植物精油的最小抑菌濃度

為了進一步確定冬青油、桉葉油、互葉白千層油、迷迭香油和香葉天竺葵油的抑菌效果，試驗測定了5種植物精油的最小抑菌濃度(MIC)，結果見表1。冬青油、藍桉油、互葉白千層油、迷迭香油和香葉天竺葵油對綠木霉的最小抑菌濃度分別為0.25，4.00，2.00，4.00和0.13 μL/mL，對黑曲霉的最小抑菌濃度分別為0.13，8.00，2.00，4.00和0.50 μL/mL，對桔青霉的最小抑菌濃度分別為0.25，8.00，4.00，4.00，0.50 μL/mL。其中冬青油的抑菌優勢突出，在濃度為0.13 μL/mL時可以完全抑制黑曲霉的生長，對綠木霉和桔青霉的最小抑菌濃度均為0.25 μL/mL。香葉天竺葵油在濃度為0.13 μL/mL時可以完全抑制綠木霉的生長。互葉百千層油對3種霉菌的抑菌區間為2～4 μL/mL，迷迭香油對3種霉菌的抑菌區間均為4 μL/mL，藍桉油的抑菌效果最差。

表1 5種植物精油對3種霉菌的最小抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of five plant essential oils on three molds

2.3 5種植物精油的成分分析

利用GC-MS對精油成分進行分析，得到5種植物精油總離子流圖，見圖3。總離子流圖中各成分經質譜工作站MSD ChemStation檢測，利用NIST08標準質譜圖數據庫對化合物質譜進行檢索對照，確定各種化學成分，并按色譜峰面積歸一化法計算各成分的相對百分含量。

a)冬青油；b)藍桉油；c)互葉白千層油；d)迷迭香油；e)香葉天竺葵油。圖3 5種植物精油的離子流圖Fig. 3 Total ion chromatograms of five plant essential oils

由圖3a可知，冬青油僅檢測出水楊酸甲酯1種成分。相關研究報道了水楊酸甲酯是通過破壞細胞的完整性使重要離子從真菌細胞膜滲漏，從而導致膜通透性紊亂，細胞死亡，在抑制食品霉變上有很好的效果[15]。本研究的結果也表明，冬青油能很好地抑制綠木霉、黑曲霉和桔青霉的生長。

由圖3c可知，互葉白千層油分離出36種成分，其主要成分有4-萜烯醇(42.68%)、γ-松油烯(13.69%)、(+)-4-蒈烯(6.32%)、對傘花烴(5.94%)、α-松油醇(4.59%)、萜品油烯(2.56%)，其中碳氫化合物共27種，占47.72%，醇類化合物共9種，占51.44%，酸類只有一種，占0.84%。其成分符合國家標準規定，即4-萜烯醇≥30%，1,8-桉葉素≤5%。Yu等[18]研究發現互葉白千層油中主要是4-萜烯醇通過破壞膜的完整性并增加滲透性，導致離子泄漏和膜功能障礙，其次起作用的成分為α-松油醇、萜品油烯，然后是1,8-桉葉素，還證明了4-萜烯醇可使細胞膜破裂，與1,8-桉葉素組合增加了細胞外的電導率，具有協同效應。Terzi等[19]也證實互葉白千層油中4-萜烯醇和1,8-桉葉素對真菌有較強的抑制效果。Li等[20]發現γ-松油烯在互葉白千層油中也占有較大的成分，該成分有較好的抑菌活性，但效力低于4-萜烯醇。An等[21]證實了互葉白千層油在抑制黑曲霉中α-松油醇和4-萜烯醇具有較強的抑制作用。本試驗也表明，互葉白千層油對3種霉菌有一定的抑菌效果，但不如冬青油和香葉天竺葵油效果好。可能是互葉白千層油抑制霉菌的活性成分主要是4-萜烯醇、α-松油醇、γ-松油烯，存在4-萜烯醇與1,8-桉葉素的協同效應，其他活性成分對抑菌也有協同效應，但成分較少，抑菌活性不明顯。

由圖3d可知，迷迭香精油分離出38種成分。含量較高的化合物有1,8-桉葉素(21.02%)、馬鞭草烯酮(16.89%)、3-蒈烯(15.14%)、香葉醇(5.72%)、龍腦(4.77%)、芳樟醇(3.25%)、檸檬烯(2.95%)。Prieto等[22]實驗證明馬鞭草酮對赤霉病鏈霉菌有極好的抑制作用，同時也具有抗腫瘤抗蟲的廣譜抑菌性。Souza等[23]研究發現亞馬遜河的Aniba物種APEA含有40%的芳樟醇對黃曲霉、黑曲霉、鐮刀菌、黑穗病菌和炭疽菌均有顯著的抗真菌作用。丁雄等[24]對龍腦樟鮮葉揮發油成分研究時發現龍腦對細菌、酵母菌和霉菌均有一定的抑菌作用。王雪梅等[25]研究發現檸檬烯對真菌的抑菌活性比梨酸鉀和苯甲酸鈉更有優勢，對灰葡萄孢菌的抑制顯著高于月桂烯。因此，在迷迭香精油抑制真菌生長的過程中起主要作用的成分可能是馬鞭草烯酮、香葉醇、芳樟醇、龍腦和檸檬烯。

由圖3e可知，中香葉天竺葵油分離出41種成分，主要成分為β-香茅醇(48.74%)、甲酸香草酯(16.33%)、薄荷酮(6.29%)、β-人參烯(3.33%)、香葉醇(2.34%)、惕各酸苯乙酯(2.25%)。廖澤東等[26]通過體外抑菌實驗研究香葉醇與檸檬醛聯合使用對金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，發現兩者具有協同作用。Ortega-Ramirez等[27]的研究表明，檸檬醛和香葉醇抑制大腸桿菌的浮游生物生長，最小抑菌濃度僅1.0和3.0 mg/mL。吳建挺[28]研究發現，香茅醇和薄荷酮對灰葡萄孢和禾谷鐮刀菌均表現出突出的抑菌活性。檸檬醛雖在精油含量中所占比例不大，但抑菌效果較強[29]。香葉天竺葵油成分中的β-香茅醇、香葉醇、薄荷酮和檸檬醛均表現出不同的抑菌活性，本研究也表明了香葉天竺葵油有較好的抑菌活性。

2.4 水楊酸甲酯的最小抑菌濃度

抑菌活性試驗結果表明，冬青油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑菌效果較好，而且成分分析中僅檢測出水楊酸甲酯1種成分。因此，本研究進一步測定分析純水楊酸甲酯試劑對3種霉菌的最小抑菌濃度，結果見表2。由表2可知，水楊酸甲酯與冬青油的最小抑菌濃度結果一致，表明水楊酸甲酯試劑與天然提取的冬青油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉具有相同的抑菌效果。

表2 水楊酸甲酯的最小抑菌濃度Table 2 The minimum inhibitory concentrations of methyl salicylate

3 結 論

云南省植物資源豐富，為植物精油的提取提供了充足的原料。本研究探索了冬青、藍桉、互葉白千層、迷迭香和香葉天竺葵中揮發油的抑菌活性和成分。從抑菌效果來看，冬青油和香葉天竺葵油對綠木霉、黑曲霉和桔青霉的抑制作用均明顯優于藍桉油、互葉白千層油和迷迭香油；互葉百千層油和迷迭香油對3種霉菌的抑菌活性較弱；藍桉油對3種霉菌的抑菌效果最差。最小抑菌濃度結果顯示，冬青油對桔青霉、綠木霉和黑曲霉的最小抑菌濃度區間為0.13～0.25 μL/mL；香葉天竺葵油僅次于冬青油。通過GC-MS分析和分析純水楊酸甲酯最小抑菌試驗推斷，冬青油中起抑菌作用的是水楊酸甲酯；藍桉油最主要成分是1,8-桉葉素，占82.38%；互葉白千層油、迷迭香精油和香葉天竺葵油分別有36，38和41種成分，3種精油中最主要的成分都是醇類化合物，分別占53.63%，45.80%和51.44%。除冬青油僅有水楊酸甲酯一種成分外，其他4種植物精油成分復雜，其抑菌作用可能是由成分之間相互協同作用的結果。本研究不僅促進了對精油抑菌性能的了解，更為下一步研發復合精油抑菌產品提供了思路。