HOXB9基因與腦膠質瘤替莫唑胺化療耐藥的相關性

余直臻 喻喆 方立萍

(大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116023)

腦膠質瘤生長迅速，侵襲性、浸潤性強，正常腦組織與腫瘤組織之間界限模糊，外科治療徹底清除病灶組織難度系數大，且因諸多藥物難以進入血腦屏障，化療藥物長時間使用后會出現耐藥性等因素影響，即使是為患者采用外科手術聯合放化療輔助方案，治療效果也不理想，因此開發高效的治療靶點來提高腦膠質瘤的整體化療獲益亟不可待〔1〕。替莫唑胺屬于腦膠質瘤治療一線藥物，但患者易對其產生耐藥，影響治療效果，既往研究指出，替莫唑胺的耐藥性與多耐藥蛋白密切相關〔2〕。而多重耐藥主要表現為多重耐藥相關分子的表達異常，如P糖蛋白(P-gP)、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)、DNA錯配修復(MMR)系統等〔3〕。人類mut-s同系物(hMLH)、hMSH2是參與錯配修復功能的重要基因，hMLH、hMSH2基因的穩定性將直接影響細胞的錯配修復功能，而HOXB9隸屬于HOX基因家族，在諸多惡病質如乳腺癌、肺癌等中表達異常，在促進腫瘤病灶生長、侵襲、凋亡等過程中舉足輕重〔4〕。由此考慮腦膠質瘤患者在替莫唑胺化療過程中，HOXB9基因表達是否異常，基因的表達情況是否與替莫唑胺化療耐藥存在某種關聯。本研究旨在通過觀察腦膠質瘤化療患者HOXB9基因與多藥耐藥相關分子表達情況其上述指標之間的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究方法與思路的設計均嚴格遵照醫學倫理委員相關規定，且均在取得患者和(或)監護人同意后整理臨床資料。回顧性分析2018年1月至2020年4月大連醫科大學附屬第二醫院完成化療且符合條件的腦膠質瘤患者的臨床資料，納入標準：①均經磁共振成像技術確診為腦膠質瘤；②外科術后均接受替莫唑胺化療；③患者病理組織封存完好；④臨床治療保存完善。排除標準：①已經出現遠處繼發性轉移；②合并其他部位惡病質者；③身體素質低下，難以耐受化療者；④心臟、腎等重要臟器失功。最終納入82例腦膠質瘤患者，其中男42例，女40例；年齡60～78歲，平均(69.52±2.19)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤35例，膠質母細胞瘤24例，少枝膠質細胞瘤15例，其他8例。腦膠質瘤患者替莫唑胺耐藥性情況分為耐藥組34例，非耐藥組48例。耐藥組男17例，女17例；年齡60～77歲，平均(69.23±2.15)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤14例，膠質母細胞瘤10例，少枝膠質細胞瘤8例，其他2例。非耐藥組男25例，女23例；年齡60～78歲，平均(69.61±2.21)歲；腫瘤類型：星形細胞瘤21例，膠質母細胞瘤14例，少枝膠質細胞瘤7例，其他6例。兩組基線資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2替莫唑胺化療耐藥判定 替莫唑胺化療患者藥物敏感性分析參照文獻〔5〕中方法進行判定。

1.3儀器與試劑 人惡性腦膠質瘤株U251由中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所提供；胎牛血清、DMEM由美國Solarbio公司生產，噻唑藍(MTT)試劑盒選自碧云天生物技術有限公司，Tranawall小室由美國Corning公司生產，兔抗人HOXB9及兔抗人IgG二抗均選自美國Abcam公司，引物的設計合成由上海吉瑪制藥技術有限公司完成，cDNA逆轉錄的PrimeScript逆轉錄試劑盒由北京康為世紀生物科技有限公司提供，熒光定量PCR試劑盒選擇SYBR Premix ExTaqTMⅡ，均由北京康為世紀生物科技有限公司提供，兔抗人MGMT、hMSH2、hMLH多克隆抗體均選自武漢博士德公司，EnVisionTM兔/鼠型染色試劑盒由上海基因公司提供。

1.4標本處理 所有標本常規固定、脫水、切片、石蠟包埋、蘇木素染色。上述所有操作嚴格遵照試劑、儀器、試劑盒說明書進行，且整個操作過程均由專業人員在嚴格質控下完成。

1.5HOXB9基因〔6〕參照文獻〔7〕中判定方法：選取5個高倍視野(細胞計數>200)觀察陽性細胞染色強度并計算陽性細胞占比，判定細則為：染色陽性信號為細胞核出現棕黃色顆粒，0分無染色，1分淺黃色，2分黃色，3分棕黃色；再按照陽性細胞占比計分：0分為陽性細胞占比<5%，1分為≥5%且<25%，2分為≥25%且<50%，3分為≥50%且<75%，4分為≥75%，兩者相乘為最終積分，并根據最終得分作為染色程度進行統計學計算。

1.6P-gP與MGMT結果判定 參照文獻〔7〕中相關判定方法，陽性：腦膠質瘤細胞膜或胞質內可見棕黃色顆粒且占比10%～30%，強陽性：陽性細胞數占比≥30%；陰性：陽性細胞數占比<10%。

1.7hMLH與hMSH2 參照文獻〔8〕中相關判定方法 隨機選擇切片中10個高倍視野內400個腦膠質瘤細胞中陽性細胞占比，陽性：腦膠質瘤細胞內可見棕黃色的顆粒，且陽性細胞占比≥25%，陰性：陽性細胞占比<25%。

上述判定結果均將武漢博士德公司提供的陽性切片作為陽性對照，5%胎牛血清替代一抗視為陰性對照，且本次研究將陽性、強陽性均視為陽性。

1.8統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行χ2檢驗、Spearman分析及Logistic回歸分析。

2 結 果

2.1HOXB9基因與多藥耐藥相關分子表達 與非耐藥組相比，耐藥組HOXB9、P-gP、MGMT陽性率較高，hMLH、hMSH2陰性率較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組HOXB9基因與多藥耐藥相關分子表達對比〔n(%)〕

2.2HOXB9基因與多藥耐藥因子相關性分析 HOXB9基因與P-gP、MGMT表達呈正相關(r=0.815、0.876，均P<0.001)，HOXB9基因與hMLH、hMSH2呈負相關(r=-0.213、-0.254，均P<0.05)。

2.3HOXB9基因對腦膠質瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥的回歸分析 將腦膠質瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥情況作為因變量，HOXB9基因作為自變量，經Logistic回歸分析證實，HOXB9基因陽性表達可能是腦膠質瘤患者替莫唑胺化療耐藥的影響因素(OR>1，P<0.001)。見表2。

表2 HOXB9基因對腦膠質瘤患者替莫唑胺化療耐藥的回歸分析

3 討 論

腦膠質瘤耐藥機制繁冗復雜，盡管臨床關于惡病質耐藥基因及其產物的研究諸多，但有關人腦膠質瘤患者采取替莫唑胺化療時耐藥基因與腦膠質瘤耐藥性的關系尚未明確。探究耐藥基因與腦膠質瘤患者耐藥性之間的關系，對降低腦膠質瘤患者對替莫唑胺的耐藥性，提高臨床化療效果尤為重要。

研究顯示，腦膠質瘤患者化療產生耐藥性是由多種因素相互作用的結果，總結分析造成腦膠質瘤患者對化療產生耐藥性的原因可能有：①化療藥物難以透過血腦屏障；②蓄積在腦膠質瘤細胞中的藥物較少；③諸多化療藥物解毒、代謝進程加快；④DNA損傷修復影響等〔9〕。近期，隨著臨床對腦膠質瘤化療耐藥性的研究不斷深入，初步得出HOXB9基因、多耐藥相關分子的表達產物P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2等與腦膠質瘤患者化療耐藥性密不可分〔10〕。替莫唑胺富含咪唑四嗪環，屬于臨床腦膠質瘤一線化療藥物，容易透過血腦屏障，致使腦膠質瘤細胞DNA烷基化，進而發揮細胞毒性作用〔11〕。替莫唑胺雖一定程度上改善了患者預后，但有效率較低，尤其是對復發性腦膠質瘤患者的有效性更低，造成這一現象的主要原因主要與腦膠質瘤患者對替莫唑胺的耐藥性增加有關〔12〕。由此可見，探尋逆轉耐藥的高效途徑，對提高腦膠質瘤患者的化療效果尤為關鍵。

HOXB9基因隸屬于Hox轉錄因子家族，研究表明，Hox家族成員不僅參與胚胎發育、干細胞自我修復更新、組織重建等生理過程，與諸多惡病質發生、進展也密不可分，此外還能夠編碼轉錄因子，調節基因彼此之間的協同表達〔13〕。劉琪等〔14〕研究發現，HOXB9基因屬于腫瘤抑制因子，沉默的HOXB9基因在甲狀腺乳頭狀癌增殖、侵襲中舉足輕重，臨床可將其作為甲狀腺癌的治療新靶點。由此證實，HOXB9基因可為惡病質疾病治療提供新思路。

MGMT屬于DNA修復酶，可幫助染色體躲避烷化劑的損傷，MGMT可有效修復被烷基化的鳥嘌呤，阻止DNA交鏈形成，從而達到降低化療藥物細胞毒性〔15〕。P-gP在具有分泌與排泄雙重功能的細胞膜上分布，主要生理作用即維持器官正常生理作用、運輸、轉化激素、調節細胞吞噬、排泄代謝產物、藥物解毒等〔16〕。P-gP屬于能量依賴性藥物輸出泵，不僅存在與抗腫瘤藥物的結合位點，也含有ATP結合位點，因此，P-gP一旦結合某種抗腫瘤藥物，便可通過ATP產生能量，將抗腫瘤藥物泵出病灶細胞，而病灶細胞內抗腫瘤藥物濃度變化因此下降，藥物的抗腫瘤作用因此削弱，抗腫瘤藥物的耐藥性因此出現〔17〕。hMLH、hMSH2是參與錯配修復功能的主要基因，對控制基因突變與維持DNA復制保真度意義重大，在錯配修復系統中任意一個基因突變都可造成細胞錯配修復功能丟失，出現復制錯誤或不穩定〔18〕。本研究結果表明HOXB9基因的表達情況可能與腦膠質瘤患者采取替莫唑胺化療時產生耐藥性有關。HOXB9基因陽性表達率高可能是造成腦膠質瘤患者采取替莫唑胺化療時產生耐藥性的影響因素。鑒于此，臨床可在腦膠質瘤患者開展替莫唑胺化療前，通過對HOXB9基因異常表達進行及時合理干預，旨在降低腦膠質瘤患者開展替莫唑胺化療時的耐藥率。但本研究納入的樣本數量較少，研究結論缺乏臨床論據證實，因此，本研究結論的可信度還需在未來開展更多的相關性研究加以驗證，旨在指導臨床腦膠質瘤患者的化療。

綜上所述，HOXB9基因與P-gP、MGMT、hMLH、hMSH2諸多耐藥分子之間關系密切，HOXB9基因可能是造成腦膠質瘤患者開展替莫唑胺化療時產生耐藥的危險因素，在開展替莫唑胺化療前，可通過監測腦膠質瘤患者體內HOXB9基因表達情況，針對異常表達者，及時干預治療，旨在降低腦膠質瘤患者開展替莫唑胺化療時的耐藥率。