NSCLC縱隔淋巴轉移與患者胸水及血水性質的相關性

楊聲灼 劉達富 鄧宇江

(廣西賀州人民醫院 1呼吸科，廣西 賀州 542800；2心胸外科)

肺癌主要包括小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占75%～80%〔1〕。目前，手術是治療NSCLC主要手段，并隨著胸腔鏡技術設備、手術方法與微創手術指征的逐漸改變，胸腔鏡微創手術已經成為NSCLC患者的常見方式〔2〕。其中胸腔鏡單孔根治術發展較為迅速，手術適應指征不斷擴寬至肺癌根治術與肺葉切除術等〔3〕。同時，胸腔鏡單孔根治術具有手術創傷程度小、術后恢復時間短與住院時間短等優勢〔4〕。胸水及血水則是評估肺癌患者預后狀況常用的生物學標本，血管內皮生長因子(VEGF)具有高度特異性，可以促進血管通透性、細胞外基質變性及血管內皮細胞遷移和增殖等，同時也與血管形成有關。既往研究提示〔5～8〕VEGF水平與肺癌發生關聯緊密，并且VEGF的高表達通常是腫瘤患者預后不良的重要指征。本研究擬分析胸水脫落細胞DNA含量，包含異倍體DNA含量等，以期從細胞生物學角度為患者預后轉歸的預測提供參考；擬對NSCLC縱隔淋巴轉移與患者是否出現胸水及血水性質的相關性進行分析。

1 對象和方法

1.1研究對象 于2013年3月至2016年3月(隨訪時間為3年，實際研究結束日期為2019年3月)采用定群抽樣的方法連續收集登記住院的NSCLC患者72例，包含59例縱隔淋巴轉移患者及13例未見腫瘤轉移的患者。入選標準：①患者通過病理活檢確診為NSCLC；②患者在本研究指定的醫院接受全程治療。排除標準：①患者中途轉院治療導致后期隨訪失敗的病例；②在了解本研究目的后不愿配合調查研究的病例。

1.2研究方法 手術器械：胸腔鏡(德國史托斯公司)，胸腔鏡手術操作器械(中國深圳市和宏實業有限公司)，內鏡直線切割縫合器(美國美敦力公司)，內鏡適配釘倉(美國強生公司)，超聲刀(美國強生公司)等。全部患者全身麻醉滿意后進行雙腔氣管插管，取健側90°臥位，采用健側單肺通氣模式，根據手術前醫學影像學數據在腋前線與腋中線第4、5肋取3～5 cm長度的切口作為操作孔。在該切口插入胸腔鏡探查，同時取第7、8肋間隙作為觀察孔。對于手術前懷疑診斷NSCLC的患者首先進行肺葉楔形切除術，待明確冰凍病理檢查報告后采用標準肺葉切除術。術中松解肺韌帶，根據病灶部位采用單項式或解剖式分別處理血管、氣管與肺裂，再進行縱隔淋巴結清掃術。患者在切口后緣或肌層下潛行上一肋間隙切口后緣置入24號引流管，患者術后采用靜脈鎮痛泵處理。DNA在波長260 nm左右可見較強的吸收峰，針對NSCLC縱隔淋巴轉移患者的胸水脫落細胞進行DNA含量測定，測定中使用分光光度法完成，檢測得到二倍體和異倍體的腫瘤細胞DNA指數，研究對非整倍體細胞峰值進行定量計算(-lgT=a×c，a為吸光系數，c為濃度)。研究中還對胸水脫落細胞的VEGF表達進行測定分析，使用免疫組化法完成測定，測定得到吸光度擴增曲線及相關參數，包括R值、R2值、擴增效率、標準曲線公式等，并對待測樣品初始模版量進行計算評價。對受試對象進行定期隨訪收集生存信息，隨訪過程主要采用微信、電子郵件、電話聯系等媒介手段記錄生存情況。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件采用描述性統計學指標對患者的基本情況進行統計學描述后使用不同檢驗方法完成組間對比；采用t檢驗或兩獨立樣本秩和檢驗淋巴轉移患者中位生存時間的影響因素；采用散點圖描述胸水脫落細胞DNA含量及VEGF表達評定對NSCLC縱隔淋巴轉移患者生存時間的相關性，并計算相關系數r值；采用H檢驗分析影響患者生存的因素，同時繪制生存曲線比較不同組別NSCLC縱隔淋巴轉移患者的生存情況差異。無特殊說明情況下顯著性水平α=0.05，所有P值表示雙側概率。

2 結 果

2.1患者一般資料 患者平均年齡(67.31±6.03)歲，男44例，吸煙史超過30年39例，有肺惡性腫瘤家族史12例，具備高危職業危害因素13例。從隨訪日開始計算起患者的生存時間最短為1個月，最長為34個月，生存中位時間為14個月；受試對象生存時間不超過6個月的23例，生存時間超過24個月的14例。

2.2胸水脫落細胞DNA含量及VEGF表達情況及其與病程的相關性 患者共出現胸腔積液32例，其中胸腔積液中含有血性成分的患者23例。胸水脫落細胞二倍體DNA含量為(245.74±34.35)U/ml，標準曲線為y=0.914x-0.415，異倍體DNA含量(75.09±13.27)U/ml，標準曲線為y=0.944x-0.284；VEGF含量為(29.20±4.90)U/ml，熒光擴增曲線的R=0.840，R2=0.704，擴增效率為85.30%。胸水脫落細胞異倍體DNA含量(r=-0.663，P<0.05)及VEGF表達豐度值(r=-0.537，P<0.05)均與患者的生存時間呈負相關。見圖1和圖2。

圖1 胸水脫落細胞異倍體DNA含量與生存時間相關性

圖2 胸水脫落細胞VEGF含量與生存時間的相關性

2.3NSCLC縱隔淋巴轉移患者生存分析

2.3.1NSCLC縱隔淋巴轉移患者生存時間的影響因素 對影響患者中位生存時間的因素進行分析，以109例有效觀察對象測定值的均數或中位數作為高水平和低水平的劃定依據，可見胸水性質、年齡、體重指數(BMI)水平、吸煙年限、吸煙量、胸水脫落細胞異倍體DNA含量及胸水脫落細胞VEGF含量是患者中位生存時間的影響因素。見表1。

表1 患者基本人口學和病理特征與中位生存時間的關聯〔M(Q1～Q3)，個月〕

2.3.2NSCLC縱隔淋巴轉移潛在影響因素分析 單因素分析結果提示，與NSCLC縱隔淋巴轉移有關的潛在危險因素包括男性、吸煙年限增加、吸煙量增加、出現血性胸水及胸水脫落細胞二倍體DNA含量低、異倍體DNA含量高和VEGF含量低；進一步在單因素分析基礎上行多因素回歸分析，表明吸煙量增加、出現血性胸水及胸水脫落細胞二倍體DNA含量低、異倍體DNA含量高和VEGF含量低為NSCLC縱隔淋巴轉移的獨立危險因素。見表2。

表2 NSCLC縱隔淋巴轉移潛在影響因素的單因素和多因素分析

2.3.3NSCLC縱隔淋巴轉移患者生存曲線比較 由圖3和圖4可以看出，胸水含有血性成分組的胸水脫落細胞異倍體DNA含量(χ2=11.264，P<0.05)及VEGF含量(χ2=16.946，P<0.05)的NSCLC縱隔淋巴轉移患者其整體生存時間均短于不含有血性成分組及低水平組的患者，且均具有統計學意義，因此可以認為高水平VEGF含量、胸水含有血性成分是NSCLC縱隔淋巴轉移患者預后不良的危險因素。

圖3 不同胸水成分NSCLC縱隔淋巴轉移患者的生存曲線比較

圖4 不同胸水脫落細胞VEGF含量NSCLC縱隔淋巴轉移患者的生存曲線比較

3 討 論

本研究結果認為對胸水中血性成分及VEGF含量進行檢測有助于了解患者的預后情況。胸水中含有血性成分的患者大多會伴有胸痛的臨床表現，預后不良的根本機制可能與神經調節作用有關，其對于神經元鈉通道電流具有一定的影響，且在炎癥性滲出物壓迫神經末梢引起的疼痛具有促進作用。因此，BK、SP可作為高敏感性疼痛應激指標應用于臨床疼痛程度的評定中〔9～12〕。VEGF則在調節肌肉收縮具有重要的作用。因此，在肌肉組織損傷引起的疼痛中的檢測具有重要的應用價值。

腫瘤的發生目前被認為是多基因聯合多階段變異的結果，有研究提示VEGF基因突變導致其編碼的蛋白有更強的激酶活性和催化效率，在多種不同惡性腫瘤的發生和發展中起作用。其可以使胞外的活化信號更加強烈地向胞內表達，從而引發腫瘤細胞持續異常增殖。本研究以患者的胸水脫落細胞研究對象，胸水量本身與患者的病程存在關聯，因此通過匹配、分層及多因素分析等設計潛在的混雜。既往研究提示，DNA異倍體對于惡性腫瘤患者預后具有重要診斷價值，并且受到拷貝數變異(CNV)的嚴重影響〔9,10〕。基因組上長度超過1 kb的片斷在不同個體間CNV，其在人類基因組中的分布可影響至少10%的序列，同時也被證實與多種復雜疾病相關。