預電針調節膽堿能神經相關蛋白對AD樣大鼠學習記憶能力及腦內炎癥的影響

黃重生 何川 陳虹茹 余超超 王雪松 姜韜 盧威 孔立紅

(湖北中醫藥大學針灸骨傷學院 針灸治未病湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(AD)是中樞神經系統(CNS)退行性疾病，以進行性記憶減退和認知功能障礙為主要臨床特征〔1〕。到 2050年全球AD患者數量預計將達到1.315億〔2〕，而全球經濟成本預計將達到59.14萬億元人民幣(9.12萬億美元)〔3〕，給世界帶來沉重的社會和經濟負擔。臨床上對AD的治療主要采用乙酰膽堿酯酶抑制和天冬氨酸受體抑制劑，但效果有限，只能適當改善臨床癥狀〔4〕，且由于AD神經元病理損傷的不可逆性，其病程往往難以逆轉〔1〕，因此研究AD早期防治策略具有重要的臨床意義。慢性腦內炎癥在AD病程中起關鍵作用，炎癥反應產生的氧化自由基和其他神經毒性物質會破壞神經細胞的結構，炎癥因子則會加速神經元的凋亡，因此對于AD的預防和治療，腦內炎癥是重要靶點〔5〕。膽堿乙酰轉移酶(ChAT)、α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)是膽堿能神經系統的重要蛋白，參與膽堿能抗炎通路(CAP)，在炎癥反應中起重要作用〔6〕，激活α7nAChR可降低腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β、IL-6的釋放，減輕炎癥反應〔7〕，促進AD空間、位置及長、短期記憶的恢復〔8〕。以往的臨床研究也表明電針在AD的臨床防治中能起到重要作用〔9～12〕。因此本研究以AD腦內炎癥為靶點，以針灸“治未病”理論為指導，探討預電針對膽堿能相關蛋白的調控及對AD學習記憶能力障礙和腦內炎癥的防治作用，以期為推廣針灸“治未病”防治AD 提供依據。

1 材料及方法

1.1實驗動物及分組 清潔級健康雄性SD大鼠40只，體重(350±20)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018。大鼠飼養于湖北中醫藥大學針灸研究所，分籠飼養，自由攝食、飲水，動物房室溫(25±2)℃，濕度(45±10)%。適應性喂養1 w后通過Morris水迷宮實驗剔除學習記憶異常的大鼠，剩30只，將大鼠隨機分為正常組、模型組、預電針組，每組10只。

1.2主要儀器和試劑 中研太和牌一次性無菌針灸針(天津億朋醫療器械有限公司)、HANS-200A韓式電針儀(南京濟生醫療科技有限公司)、Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司)、KL-Ⅰ型生物組織自動包埋機(湖北康龍電子科技有限公司)、Finesse325旋轉石蠟切片機(英國珊頓公司)、共聚焦顯微鏡(德國徠卡顯微系統公司，儀器型號TCS SP8)。α7nAChR抗體(英國Abcam)，離子鈣接頭蛋白(Iba)-1抗體(英國Abcam)，ChAT抗體(美國Proteintech Group)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(上海碧云天生物技術有限公司)，TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司)，免疫組化試劑盒(中杉金橋公司)。

1.3造模方法 采用腹腔注射D-半乳糖溶液制備AD樣大鼠模型。每組大鼠每周按時稱重，記錄體重，按照150 mg/kg配制注射液，根據大鼠體重計算出每次注射量，模型組與預電針組每天連續腹腔注射D-半乳糖溶液，正常組每天注射生理鹽水，持續8 w〔13，14〕。

1.4電針干預方法 每日造模完成后，對預電針組大鼠進行電針治療，治療取臨床治療AD的常用穴百會穴、足三里穴〔15〕，參照《實驗針灸學》〔16〕進行選穴定位。百會穴位于頂骨正中，足三里穴位于膝關節后外側，在腓骨頭下5 mm處。針刺選用0.25 mm×13.00 mm一次性無菌針灸針，百會穴向前斜刺2 mm，足三里穴直刺7 mm，針刺后連接上HANS-200A 電針儀，電極分別接百會穴和足三里穴，單日接左側足三里穴，雙日接右側足三里穴，左右側足三里穴交替使用。選用電流為1 mA，頻率為50 Hz的連續波，以大鼠肢體顫動、無嘶叫聲為佳，每日治療1次，每次治療20 min，連續治療6 w，正常組常規飼養，模型組同步抓取固定20 min〔17，18〕。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1Morris水迷宮實驗檢測大鼠行為學 水迷宮裝置周圍避光，水溫保持(25±2)℃。(1)定位航行實驗：于治療結束第2天開始，平臺位于第4象限正中，距水面2 cm，將大鼠依次從四個象限之一面向池壁放入水中，記錄其找到平臺的時間，即為其逃避潛伏期。若大鼠在120 s內找到平臺，則可停留休息15 s，若未找到，則由實驗人員將其引上平臺，同樣停留15 s，記錄其逃避潛伏期為120 s。每個象限完成后休息1 min，再進行下一個象限，實驗持續5 d。(2)空間探索實驗：第6天撤除平臺進行空間探索實驗，在四個象限中任選1個作為入水點，將大鼠面向池壁放入水池中，記錄大鼠120 s內的游泳路徑及其在原平臺象限的停留時間和穿越原平臺區域的次數。

1.5.2免疫組織化學法檢測海馬CA3區ChAT陽性細胞的表達 水迷宮實驗結束后，各組大鼠用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉(3 ml/kg)，每組取5只大鼠灌注固定后取腦。石蠟包埋切片。常規脫蠟后進行微波加熱抗原修復，自然冷卻，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，封閉，孵育，滴加ChAT一抗，4℃過夜，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，孵育1 h，滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，孵育，二氨基聯苯胺(DAB)染色，滴加蘇木素復染，1% HCl溶液分化，脫水，封片，拍照，用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析。

1.5.3免疫熒光法檢測海馬CA3區小膠質細胞的陽性表達 常規脫蠟后進行微波加熱抗原修復，常溫冷卻，山羊血清封閉，滴加Iba-1抗體(1∶100)，4℃過夜，滴加Cy3二抗，孵育，滴加DAPI，PBST沖洗，封片，在共聚焦顯微鏡下采集圖像。

1.5.4Western印跡法檢測大鼠海馬組織α7 nAChR、Iba-1蛋白表達水平 每組取5只大鼠斷頭取腦，取新鮮海馬保存。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗組織，離心管中振蕩冰浴后收集上清液，用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測蛋白濃度，以每個孔40 μg蛋白為標準進行上樣，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳。300 mA恒流轉膜，封閉1 h，加一抗4℃過夜，TBST清洗，加二抗，室溫孵育2 h，TBST搖床上清洗。滴加電化學發光(ECL)混合溶液，曝光，用Image-Pro Plus6.0分析目標條帶的灰度值，以目標帶的吸光度值與內參β-actin吸光度值之比作為α7nAChR、Iba-1的相對表達量。

1.5.5ELISA檢測大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度 用96孔的ELISA試劑盒分別檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度，實驗步驟參照試劑盒說明書。

1.6統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行雙因素方差分析、單因素方差分析、Bonferroni法。

2 結 果

2.1各組行為學比較 納入大鼠均正常完成實驗，無脫落及死亡。與正常組比較，模型組大鼠水迷宮逃避潛伏期顯著更長(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，預電針組大鼠水迷宮逃避潛伏期顯著更短(P<0.05,P<0.01)。見表1。與正常組比較，模型組大鼠在原平臺象限停留時間顯著更短(P<0.05)，穿過原平臺所在位置的次數顯著更少(P<0.01)；與模型組比較，預電針組大鼠在原平臺象限停留時間顯著更長(P<0.01)，穿過原平臺所在位置的次數顯著更多(P<0.05)。見表2。

表1 各組水迷宮逃避潛伏期

表2 各組原平臺象限停留時間和穿過原平臺位置次數

2.2各組海馬區炎癥因子的含量的比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，預電針組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達顯著減少(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 各組海馬區IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度比較

2.3各組海馬區α7nAChR、Iba-1蛋白表達的比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬區α7nAChR蛋白表達顯著減少(P<0.01)，Iba-1蛋白表達顯著增多(P<0.01)；與模型組比較，預電針組大鼠海馬區α7 nAChR蛋白表達顯著增多(P<0.05)，Iba-1蛋白表達顯著減少(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組海馬區α7nAChR、Iba-1蛋白表達

表4 各組海馬區α7nAChR、Iba-1蛋白相對表達量的比較

2.4各組海馬CA3區ChAT陽性細胞表達的比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬CA3區ChAT陽性細胞表達更少，平均光密度值更低(0.017±0.001 vs 0.013±0.001；P<0.01,n=5)；與模型組比較，預電針組大鼠海馬CA3區ChAT陽性細胞表達更多，平均光密度值(0.015±0.001)更高(P<0.01，n=5)。見圖2。

圖2 各組海馬CA3區ChAT陽性細胞表達的比較(DAB，×400)

2.5各組海馬CA3區小膠質細胞活化的比較 與正常組比較，模型組大鼠海馬CA3區活化的小膠質細胞數量增多，熒光強度升高(1.449±0.090 vs 2.207±0.161；P<0.01)；與模型組比較，預電針組大鼠海馬CA3區活化的小膠質細胞數量減少，平均熒光強度(1.806±0.073)降低(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

在中醫學上AD屬癡呆范疇，病機為髓海不足，痰瘀阻竅，治療多采用固本培元、開竅醒腦的方法〔19〕。AD被劃分為臨床前期、輕度認知障礙期、癡呆期，而在臨床前期患者大腦、腦脊液和血液等方面已有可測量性變化〔1〕。因此，以中醫治未病思想為指導，研究預電針對AD的早期干預作用具有重要的臨床意義。臨床在AD的治療上百會穴和足三里穴使用頻率較高〔15〕，百會穴有通督調神、益精填髓、開竅醒腦之功〔20〕，足三里穴有補益氣血、固本培元、強精健腦之效〔21〕，兩穴合用，標本兼治。

20世紀90年代有文獻報道患有類風濕性關節炎的病人患AD的概率降低，其原因在于患者長期服用非甾體抗炎藥〔22〕。隨后研究證實AD病程中存在腦內慢性炎癥反應，大量活化的小膠質細胞和T細胞釋放自由基和神經毒性物質及多種炎癥因子，對神經組織造成持續損傷〔5〕，同時聚集的Aβ蛋白會進一步激活炎癥反應，促使膜攻擊復合體(MAC)直接裂解神經元〔23〕，所以對腦內炎癥的治療是AD治療的重要靶向之一〔24，25〕。

CAP是指CNS接收迷走神經傳入支傳入的信號，調節迷走神經末梢釋放乙酰膽堿(Ach)，與巨噬細胞表達的α7nAchR相結合，激活酪氨酸激酶(JAK)2/信號轉導和轉錄激活因子(STAT)3及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核轉錄因子(NF)-κΒ等信號通路，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的釋放從而發揮抗炎作用的通路〔6〕。ChAT是Ach合成的核心蛋白酶，其含量反映了Ach合成量〔26〕。小膠質細胞是CNS的巨噬細胞，當其活化時會釋放大量自由基、神經毒素和炎癥因子，導致炎癥反應和神經細胞損傷〔27〕，其活化的特異性標志物是Iba-1蛋白〔28〕，其表達量反映了小膠質細胞的活化程度。研究證明針刺可激活膽堿能抗炎通路，顯著減少TNF-α和IL-1β等炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應〔29，30〕。

本研究采用D-半乳糖腹腔注射誘導的AD大鼠模型，來模擬AD患者大腦記憶障礙及炎癥表現和海馬神經損害。腹腔注射D-半乳糖會導致大鼠腦組織活性氧(ROS)增高、氧化應激、神經炎癥和神經退行性改變，導致神經突觸功能障礙及老年斑、脂褐素等病理產物的沉積，這與AD的病理特征在一定程度上相吻合〔31，32〕。長期進行D-半乳糖注射會誘導NF-κB信號通路的激活和炎癥反應，激活神經小膠質細胞，導致大鼠海馬TNF-α、IL-1β等炎癥因子的上調，加重炎癥損傷〔32，33〕。

本實驗結果表明預電針百會穴、足三里穴能上調膽堿能神經相關蛋白ChAT、α7nAChR的表達，抑制AD樣大鼠海馬區小膠質細胞的活化，減少TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌，改善大鼠學習記憶能力。這些結果與針灸對膽堿能抗炎通路的激活十分相似，表明膽堿能抗炎通路可能參與預電針的抗炎效應，其機制有待進一步深入研究。