miR-24對氧化低密度脂蛋白膽固醇誘導的人臍靜脈內皮細胞自噬的影響

楊鵬 羅雪蘭 顏淵鴛 李丹 趙燕姣 楊瑞霞 歐和生

(1廣西國際壯醫醫院，廣西 南寧 530001；2廣西醫科大學藥學院)

動脈粥樣硬化(AS)是一種血管管壁內膜的慢性炎性病變，其發生發展受多種因素的影響，其中，血管內皮細胞(VEC)損傷是AS發生發展的始動環節〔1〕。自噬是細胞在生長、分化與發育過程中實現代謝需求的關鍵過程，該過程主要通過細胞將受損細胞器與變性蛋白運輸至溶酶體進行消化降解〔2，3〕。資料表明，VEC自噬廣泛存在AS的過程中，自噬不足或自噬過度可誘導內皮細胞凋亡，從而啟動并加速AS的形成〔4〕。

微小RNA(miRNA)是一類非編碼的單鏈小RNA，它通過特異性識別靶基因mRNA的3′非轉錄區，介導靶基因mRNA的降解或翻譯抑制，從而下調靶基因的表達，并參與細胞增殖、分化、凋亡、自噬和AS病理生理等多種生物學過程〔5～7〕。miR-24屬于miR-23～27～24 家族，有研究顯示在家族性高膽固醇血癥的病人體內，miR-24的表達量顯著增加〔8〕，提示miR-24與AS的聯系密切，但具體機制尚未明了。VEC自噬對AS具有重要的病理治療意義。生理狀態下VEC通過活化自噬促進溶酶體降解氧化低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)抵御其誘導的損傷，當ox-LDL蓄積超過細胞代謝能力時，VEC受損誘發AS，此時通過增加VEC自噬的途徑可降低AS 的發生〔9〕。新近研究證明，某些miRNAs對VEC自噬具有明顯的調控作用，而miR-24與VEC自噬活性之間的關系則鮮有報道。ox-LDL是一種有效的AS促進因子，目前被廣泛用于誘導血管炎癥、損傷及AS的發生發展。本研究通過ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)自噬，探討miR-24對HUVECs自噬的調控作用及ox-LDL對HUVECs中miR-24表達的影響，進一步探討miR-24通過調控自噬在AS中發揮的作用。

1 材料與方法

1.1細胞株、儀器及試劑 HUVECs購自武漢Procell公司。透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司)；超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司)；低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2飽和濕度培養箱(美國Thermo Forma公司)；酶聯免疫檢測儀Model-450(美國Thermo Forma公司)；實時熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(PCR)儀(原應用生物系統公司)；小型高速冷凍離心機(賽默飛·世爾科技有限公司)；蛋白電泳儀、蛋白質轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；Odyssey熒光掃描成像系統(美國LI-COR CXL)。DMEM培養基(Gibco公司)；胎牛血清(Lonsera公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(Gibco公司)；ox-LDL(廣州奕源生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Solarbio公司)；RNA提取試劑盒(Axygen生物公司)；逆轉錄試劑盒及SYBR熒光定量PCR試劑盒(均購自日本TAKERA公司)；慢病毒載體(上海吉凱基化學技術有限公司)；LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1和P62抗體(均購自Cell Signaling Technology)；內參GAPDH抗體(Proteintech)，抗兔IgG(H+L)熒光二抗(Cell Signaling Technology)。

1.2方法

1.2.1miR-24慢病毒載體的構建與鑒定 以miR-24序列(來自http://www.miRbase.org)：5′UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′為根據，設計miR-24的發夾結構，應用PCR技術獲取目的基因片段，通過基因重組技術(AgeI/NheI 酶切)將目的基因克隆到GV367載體的MCS中(載體元件順序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，接著進行PCR鑒定及DNA測序比對分析確定載體形成miR-24高表達慢病毒顆粒即LV-GV367-miR-24，同體構建成功后用慢病毒包裝相應的GV367載體時根據miR-24反義序列及隨機對照序列構建LV-GV367-anti-miR-24和LV-GV367-陰性對照NC。GV367載體上含有增強綠色熒光蛋白(EGFP)標記及嘌呤霉素抗性，故已轉染細胞可見綠色熒光，且可用嘌呤霉素進行篩選，建立穩定表達目的基因的細胞株。

主要以陜西省榆林市清澗地區作為試驗所在地。該地區是典型的黃土高原丘陵溝壑區，晝夜溫差大，年均氣溫10攝氏度，年均降水450毫米，無霜期200天。

1.2.3細胞的分組及ox-LDL誘導HUVECs自噬 將實驗細胞隨機分為5組：正常組、ox-LDL組、陰性對照組、anti-miR-24組、miR-24組。正常組不給予任何干預，ox-LDL組用終濃度為100 μg/ml的ox-LDL工作液干預6 h誘導細胞自噬〔10〕。陰性對照組、anti-miR-24組、miR-24組的細胞先分別感染相應的慢病毒載體，然后用終濃度為100 μg/ml的ox-LDL工作液干預6 h誘導細胞自噬。

外賣是大多數年青上班族的午餐首選，因為午休時間短，又懶得下樓買，只得叫外賣。可是現在外賣的質量情況堪憂，如何才能健康吃外賣呢？

1.2.4qRT-PCR法檢測miR-24、LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62 mRNA的表達 按RNA提取試劑盒提取各組細胞的總RNA，并測定濃度。予上海生工生物工程提供引物設計(序列見表1)，嚴格按照RNA逆轉錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒說明進行逆轉錄和qRT-PCR。miR-24反應條件：95 ℃ 1 min變性，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個循環，以U6作為內參。目的基因反應條件：UDG酶激活2 min；95℃，2 min；95℃，15 s；60℃，15 s；72℃，1 min；第2～4步進行40個循環，以GAPDH作為內參。每個樣本重復測定3次，取平均值，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.7Western印跡法檢測LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白表達量 實驗組細胞給予ox-LDL誘導自噬后，收集培養液及培養瓶內的細胞，將各組細胞裂解，12 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液。應用二喹啉甲酸(BCA)標準曲線蛋白定量，分別取各組的蛋白30 μg進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入Ⅰ 抗(稀釋比例1∶1 000)濕盒孵育過夜(4℃)。第2 天用TBST沖洗3次，每次10 min，然后加入 Ⅱ 抗(H+L熒光標記)(稀釋比例1∶10 000)孵育1 h，重復用TBST沖洗3次，每次10 min。利用雙色熒光掃描成像系統分析蛋白電泳條帶的灰度值，計算蛋白的表達量，以GAPDH為內參，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實驗重復3次，取平均值。

2.3透射電鏡觀察各組細胞超微結構 透射電鏡觀察結果顯示(圖1)，正常組細胞的細胞質內各細胞器分布基本正常，細胞核形態正常，細胞質中偶見少量自噬小體；ox-LDL組細胞質中可見數個散在于細胞質中的雙層膜結構的自噬小體及內含細胞器的空泡狀自噬溶酶體，數量與陰性對照組相當。miR-24組細胞中的自噬小體較ox-LDL組少，細胞核形態基本正常，anti-miR-24組細胞中可見較多自噬小體。結果提示，在誘導細胞發生自噬后，過表達miR-24可抑制細胞自噬的程度。

2.1慢病毒轉染前后細胞miR-24的表達量 正常組miR-24相對表達量(1.00±0.00)與陰性對照組(1.10±0.01)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，miR-24組miR-24相對表達量(1.82±0.12)明顯高于正常組和陰性對照組，anti-miR-24組miR-24相對表達量(0.47±0.10)明顯低于正常組和陰性對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。說明miR-24組、anti-miR-24組慢病毒成功轉染HUVECs并影響細胞miR-24表達，而陰性對照組慢病毒轉染不影響細胞miR-24表達，穩轉細胞株構建成功。

1.2.5透射電鏡觀察細胞內超微結構自噬小體 分別消化收集各實驗組細胞，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗1次，低溫離心(1 000 r/min，5 min，4℃)，棄上清液，沿管壁加入提前預冷的2.5%戊二醛電鏡級固定液1 ml，置于4℃冰箱避光固定過夜。0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次,每次15 min，1.0%鋨酸溶液后固定2 h(4℃)。0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次,每次15 min，50%、70%、90%、3次100%梯度丙酮逐級脫水，每次15 min。100%丙酮∶樹脂=1∶1滲透2 h，100%丙酮∶樹脂=1∶2滲透2 h，純樹脂滲透過夜，環氧樹脂618包埋，烘箱聚合(37℃ 15 h，45℃ 12 h，60℃ 24 h)。超薄切片，厚度60～70 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，上機觀察。

把容易的問題安排給后進生答，這樣可以激發后進生的學習積極性，啟發和培養他們的思維能力。而對于成績比較優秀的學生，教師要給他們提供一些稍微有些難度的問題，讓他們通過努力思考可以得出答案。同時，老師在提出問題后，還要相機點撥，為學生的思考“架橋”，降低問題的坡度，以利于學生逐步接近“目標”，達到預期的教學效果。從學生的實際出發，面向全體，讓每個學生都成為課堂的主人、學習的主體，使得班內各層次的學生都得到發展。

1.3統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

繼續優化移民戶收入結構，加速農村勞動力轉移步伐，由出臺的勞務經濟補償機制帶動大量勞務經濟興起，不斷帶動勞務輸出，通過政策引導鼓勵農民外出務工，不斷利用扶貧培訓政策，大力提高農村勞動力素質和專業技能，大力完善勞務派遣制度。

2 結 果

大食與唐朝交往密切。唐開元四年（716）“七月,大食國黑密牟尼蘇利漫遣使上表,獻金線織袍、寶裝玉灑池瓶各一”。大食國黑密牟尼蘇利漫即白衣大食第十代哈里發蘇萊漫（sulaiman，715-717）,而“金線織袍”實物在都蘭大墓所出織金錦似乎得到了證實。

2.2ox-LDL對HUVECs中miR-24表達量的影響 用100 μg/ml ox-LDL 干預HUVECs 6 h后，用qRT-PCR法檢測正常組和ox-LDL組的miR-24相對表達量。結果顯示，ox-LDL組miR-24表達水平(0.35±0.10)均明顯低于正常組(1.00±0.00)，差異有統計學意義，提示ox-LDL可明顯下調HUVECs中miR-24表達水平。

受納入研究樣本量較少的限制，本文研究方法可能存在一定的局限性，有必要行大樣本的隨機對照研究以進一步證實。綜上所述，對于腦卒中患者采用中醫延續護理能夠顯著改善患者的臨床癥狀，提高患者的生活質量與耐受性，值得臨床實踐中應用與推廣。

1.2.6MTT法檢測細胞活性 細胞分別以每孔8×103個接種到96 孔板，待細胞貼壁后加入終濃度100 μg/ml ox-LDL藥物干預6 h。棄去培養基，每孔加入100 μl新配制MTT(工作液濃度0.5 mg/L)，37℃孵育4 h，小心棄去孔中培養液，每孔加入DMSO 150 μl，震蕩10 s，酶標儀490 nm 波長測定吸光度值(A490 nm)。實驗重復3次，取平均值。

圖1 各組細胞超微結構及自噬小體觀察結果比較(×25 000)

2.4各組HUVECs細胞活性比較 miR-24組OD值(0.35±0.08)、anti-miR-24組OD值(0.68±0.12)、陰性對照組(0.72±0.10)、ox-LDL組(0.71±0.09)均明顯低于正常組(0.89±0.04)，miR-24組OD值明顯低于陰性對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，陰性對照組與ox-LDL組、anti-miR-24組比較，差異均有統計學意義(均P>0.05)。提示表達miR-24能在一定程度上抑制HUVECs的活性。

1.2.2HUVECs轉染 HUVECs用含20%新生胎牛血清的DMEM培養液，加入雙抗：青霉素100 IU/ml和鏈霉素0.1 mg/ml，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，取生長狀態良好的細胞以每孔5×105個細胞接種到6孔板，培養24 h。3種慢病毒以感染指數MOI=70感染HUVECs，置于培養箱孵育48 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，加入嘌呤霉素(10 μg/ml)進行篩選。

2.5各組細胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1及P62蛋白相對表達量比較 Western印跡結果顯示(圖2)，陰性對照組、anti-miR-24組ox-LDL組LC3-Ⅰ/Ⅱ與Beclin-1表達明顯高于正常組，而ox-LDL組、陰性對照組、anti-miR-24組及miR-24組的P62的表達明顯低于正常組，差異均有統計學意義(均P<0.05)，說明ox-LDL能顯著誘導細胞發生自噬。anti-miR-24 組LC3-Ⅰ/Ⅱ與Beclin-1表達量明顯高于陰性對照組，P62的表達量明顯低于陰性對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。而miR-24組的LC3-Ⅰ/Ⅱ與Beclin-1表達量明顯低于陰性對照組，P62的表達量明顯高于陰性對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。提示在ox-LDL誘導細胞自噬后，過表達miR-24能抑制HUVECs自噬水平。見表2。

1～5：正常組、ox-LDL組、陰性對照組、anti-miR-24組、miR-24組

表2 各組細胞LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1及P62蛋白的相對表達量

2.6各組細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1及P62 mRNA相對表達量比較 陰性對照組、anti-miR-24組、miR-24組、ox-LDL組的LC3-Ⅱ與Beclin-1 mRNA相對表達量均明顯高于正常組，而P62 mRNA相對表達量均明顯低于正常組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。anti-miR-24 組的LC3-Ⅱ與Beclin-1 mRNA相對表達量明顯高于陰性對照組，而P62 mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組，差異均有統計學意義(均P<0.05)。miR-24 組的LC3-Ⅱ與Beclin-1 mRNA相對表達量明顯低于陰性對照組，，而P62 mRNA相對表達量明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義(均P<0.05)。提示miR-24過表達可在轉錄水平進一步下調LC3-Ⅱ與Beclin-1的表達量及上調P62的表達量。見表3。

表3 各組細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1及P62 mRNA相對表達量

3 討 論

本研究發現ox-LDL能誘導HUVECs產生自噬，同時還能下調HUVECs中miR-24的表達。進一步研究發現，miR-24對ox-LDL誘導的HUVECs自噬具有明顯的抑制作用，再一次驗證了miR-24顯著抑制HUVECs的增殖能力。因此推測過表達miR-24可通過抑制ox-LDL誘導的HUVECs自噬并抑制細胞增殖，進而發揮其在AS中的作用。

VEC在血管結構的維持與功能方面發揮著重要的作用，VEC損傷和自噬異常對AS的發生和發展有促進作用〔11〕。血管內皮受到有害刺激后會誘發自噬以保護細胞免受損傷。但是自噬異常也會導致內皮細胞的凋亡，導致內皮完整性喪失，局部脂質沉積，AS和斑塊不穩定〔12〕。自噬過程由一系列自噬相關基因(Atg)介導完成，其中以酵母自噬基因Atg6同源物Beclin-1和LC3為代表性蛋白〔13〕。自噬發生時，細胞溶質形式的LC3(LC3-Ⅰ)與磷脂酰乙醇胺(PE)綴合形成LC3-PE綴合物(LC3-Ⅱ)，被募集到自噬體膜中〔14〕。LC3-Ⅱ始終穩定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此可作為自噬體的標記蛋白〔15〕。另外，Beclin-1也可以調節自噬體的形成，而且能促進其成長成熟，亦是調控細胞自噬的必要因子〔16〕。P62是多功能的泛素化結合蛋白，它通過與LC3直接綁定，部分性地進入自噬體內，并在自噬期間被不斷分解，因此其表達程度與自噬程度具有相反性。ox-LDL作為一種刺激因素可誘導內皮細胞產生自噬，Zhang等〔17〕研究發現，ox-LDL能上調內皮細胞中自噬相關基因Beclin-1和LC3Ⅱ的表達，且分別在0.5 h和6 h時自噬蛋白的表達達到峰值。本研究結果提示，通過ox-LDL刺激可誘發HUVECs產生自噬。

miRNA是人體內的一種對基因具有調控作用的重要小分子核糖核酸，參與多種疾病的病生理過程〔18〕。當機體受到某種刺激以后，組織或細胞內的miRNA水平就會出現不同程度的上調或下調，從而發揮對機體的保護或者損害作用。有研究表明，ox-LDL可誘導細胞中的miRNA水平發生改變。Tang等〔19〕研究發現，ox-LDL以時間和劑量依賴性方式下調HUVECs中miR-21 的水平，過表達 miR-21 可增強ox-LDL誘導的HUVECs自噬，抑制AS。Chen等〔20〕報道miR-155的過表達可誘導腫瘤細胞自噬的激活，進而促進腫瘤細胞存活和化學抗性。本研究結果提示ox-LDL能下調HUVECs中miR-24的表達水平。

大多數miRNA具有抑制自噬的作用，但也有少部分miRNA具有促進自噬作用。miR-216a 通過下調Beclin1和 ATG5抑制ox-LDL誘導的自噬〔21〕。miR-214-3p可通過直接靶向ATG5的3′-UTR抑制HEK293 細胞自噬〔22〕。研究發現，miR-155可通過增強LC3和降低p62 mRNA水平增強ox-LDL誘導的HUVECs自噬。盡管目前已證實多種miRNA對細胞自噬具有調控作用，但關于miR-24與自噬的研究則鮮有報道。本研究結果提示miR-24對ox-LDL誘導的HUVECs自噬具有一定的調節作用。

VEC自噬在AS發生發展中具有重要作用，miR-24可通過調節VEC自噬的作用進而發揮其在AS中的作用。但是，本研究僅是miR-24體外實驗的初探，并且機制研究深度不夠，要進一步驗證這一機制，還需要開展下一步的體內實驗進行驗證。