α-硫辛酸通過mTOR通路抑制缺血再灌注誘導的PC12細胞自噬性凋亡

謝鵬 任真奎，3 呂菊 胡玉梅 官志忠 張春林 禹文峰

(貴州醫科大學 1分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2地方病與少數民族疾病教育部重點實驗室;3黔西南州人民醫院檢驗科；4貴州醫科大學基礎醫學院)

心腦血管疾病嚴重影響人類生活健康、生活質量〔1〕。其中腦卒中已成為全球“第二大死亡殺手”。目前，臨床的主要治療手段是溶栓治療〔2，3〕。機械溶栓(手術)或者化學藥物溶栓都是為了實現局部缺血血管血流再通〔4〕。然而，伴隨著溶栓治療會出現再灌注損傷和繼發性出血且神經細胞功能缺損加重等現象〔5，6〕。因此，尋找有效的腦卒中治療藥物或者干預治療靶點迫在眉睫。研究顯示抗氧化物質在腦卒中的病理過程具有積極保護作用〔7〕。α-硫辛酸(LA)是丙酮酸脫氫酶的輔助因子，參與三羧酸循環過程中的重要物質。α-LA被認為是生物體內的強抗氧化劑，對神經退行性疾病具有保護作用〔8～10〕。在大鼠腦中動脈栓塞(MCAO)模型和脂多糖(LPS)誘導的小膠質炎癥細胞模型中，α-LA能夠顯著恢復MCAO大鼠的神經功能和減少白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α 和IL-10 的表達，并能抑制炎癥信號通路NF-κB的激活等〔11，12〕。大量的研究結果都證明α-LA在缺血再灌注損傷的病理過程中發揮著重要作用，但是其確切的分子機制尚不清楚，有待闡明。因此本研究擬在神經細胞PC12缺血再灌注模型上探討α-LA發揮保護作用的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系與細胞培養 PC12細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，培養基配方為10%FBS+1%雙抗+89%的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。長至80%～90%匯合度進行傳代培養。

1.2實驗試劑 DMEM培養基(8119058，賽默飛世爾科技有限公司)；胎牛血清(2045512CP，美國Gibco 公司);DMEM無糖培養基(1951286，美國Gibco 公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0031019，以色列Biological Industries);蛋白酶抑制劑(#5872，CST)；R-(+)-α-LA(07039，Sigma);CCK8(A311-01，Vazyme Biotech);雙染細胞凋亡檢測試劑盒(BB-4101，貝博生物)；Hoechst 33258染色液(C1017，上海碧云天生物技術有限公司);Phospho-mTOR(Ser2448)(49F9)兔mAb(#2976，CST);mTOR(7C10)兔mAb(#2983，CST);SQSTM1/p62(D6M5X)兔mAb(#23214，CST);LC3A/B(D3U4C)XP?兔mAb(#12741，CST);重組Anti-Bax抗體(ab32503，Abcam);酶切Caspase-3(Asp175)抗體(#9661，CST)。

1.3α-LA溶解 精準電子天平秤取硫辛酸0.020 6 g，于0.5 ml DMSO中溶解后加0.5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成母液濃度100 mmol/L儲液，4℃避光保存備用。α-LA使用濃度中DMSO不超過0.1%。

1.4缺血再灌注模型建立與實驗分組 PC12細胞長至80%～90%之后，吸棄培養基，用3～5 ml預冷PBS洗滌細胞1～2次，0.25%胰酶消化細胞，含FBS完全培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，10%FBS完全培養基制成2×105個/ml細胞懸液并取1 ml細胞懸液加入每孔內，每孔再補加1 ml完全培養基，置37℃培養箱培養。待細胞密度至70%～80%時，進行缺氧/復氧處理。正常組細胞換完全培養基置正常培養箱培養，缺氧/復氧組用預冷PBS洗滌細胞2遍后，換無糖無血清DMEM培養基置于三氣培養箱(94%N2+5%CO2+1%O2)中培養4 h，模擬缺血缺氧處理后，PBS洗細胞2次更換無血清高糖培養基置于正常培養箱中培養18 h以模擬再灌注損傷;α-LA組在復氧前給予α-LA處理共培養18 h；Baf A1組在缺氧/復氧處理12 h后給予20 nmol/L的Baf A1繼續培養6 h。

1.5CCK8檢測法 細胞長至合適密度后，將細胞制成5×104/ml的細胞懸液，以每孔100 μl接種于96孔板，細胞貼壁過夜生長到50%～60%密度時，吸棄舊培養基，每孔分別加入100 μl無糖DMEM培養基，置于三氣培養箱(1%O2+5%CO2)中培養4 h，模擬缺血缺氧處理，正常組含完全培養基于正常氧培養箱中培養。缺氧處理后分別加入含不同濃度α-LA的高糖無血清培養基置于正常培養箱培養18 h行復氧處理。復氧18 h后，每孔加入10 μl CCK8工作液反應1 h左右，以空白孔調零，每組6個復孔，酶標測定儀測定450 nm波長下的吸光度值(OD)。細胞存活率=(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.6流式細胞術 PC12接種至12孔板，待細胞長至合適密度后，分組行實驗干預處理。0.25%不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶消化細胞，離心收集細胞，PBS洗細胞1次，根據貝博凋亡檢測試劑盒說明書要求操作后續步驟。緩沖液重懸細胞制成細胞懸液，加凋亡染色液反應5～10 min，上機檢測細胞凋亡變化。

1.7Western印跡分析 棄培養基，預冷PBS洗細胞一次，每孔加500 μl PBS，用細胞刮輕輕刮下細胞，離心收集，根據細胞多少加100～200 μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于振蕩器上震搖均勻，細胞于冰上充分裂解30 mins后離心收集蛋白上清，BCA蛋白定量后加入4∶1(蛋白上清∶5倍緩沖液)比例的5倍緩沖液于恒溫金屬浴100℃變性蛋白10 min，120 V恒壓十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，250 mA濕轉轉膜1.5 h，1×TBST配置的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃搖床孵育抗體過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL發光液成像檢測信號。

1.8統計學分析 采用GraphPad Prism8.0.1軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1α-LA抑制缺血再灌注誘導的PC12細胞存活率降低 與正常組比較，缺氧/復氧組細胞活性顯著降低，存活率降低至51.06%±0.97%；當給予α-LA處理后，缺氧/復氧處理的細胞存活率顯著升高，α-LA 0.010 mmol/L、0.025 mmol/L、0.050 mmol/L、0.250 mmol/L、0.500 mmol/L、1.000 mmol/L、2.000 mmol/L、2.500 mmol/L、5.000 mmol/L和10.000 mmol/L時細胞的存活率分別為52.98%±0.44%、63.91%±1.04%、66.56%±0.57%、73.68%±0.13%、85.83%±0.28%、81.10%±0.22%、78.85%±1.39%、77.08%±0.95%、69.60%±1.53%和35.66%±0.77%；α-LA在0.500 mmol/L時細胞活性升高至85.83%±0.28%，表明α-LA在0.500 mmol/L對缺氧/復氧損傷的抑制作用最強；然而，當α-LA的工作濃度在10.000 mmol/L時，PC12細胞存活率顯著受到抑制，表明較高濃度的α-LA具有毒副作用；以上結果差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.2α-LA抑制缺血再灌注誘導的PC12細胞凋亡 正常組、缺氧/復氧組和缺氧/復氧+α-LA組細胞的凋亡率分別為2.58%±0.16%、13.23%±1.09%和8.58%±0.56%，差異均有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明：缺氧/復氧誘導了PC12細胞的凋亡水平升高，當給予0.500 mmol/L的α-LA與缺氧復氧的PC12細胞共培養處理后能顯著降低缺氧/復氧誘導的細胞凋亡水平升高，顯示α-LA對缺血再灌注損傷具有抑制作用。見圖1。

圖1 各組PC12細胞凋亡

2.3Western印跡檢測自噬和凋亡相關蛋白的變化 與正常組比較，缺氧/復氧組自噬標志分子LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加，P62的表達減少；與此同時，凋亡相關分子酶切caspase-3和促凋亡蛋白Bax的表達水平增加。缺氧/復氧后給予α-LA處理能夠顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，增加P62的表達，同時降低了凋亡分子酶切caspase-3和Bax的表達，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1和圖2。

表1 Western印跡檢測PC12細胞凋亡及自噬標志分子的表達變化

1～3：正常組、缺氧/復氧組、缺氧/復氧+α-LA組

2.4Baf A1抑制缺血再灌注誘導的PC12細胞凋亡 正常組、缺氧/復氧組和缺氧/復氧+Baf A1組細胞的凋亡率分別為3.77%±0.47%、16.74%±0.86%、6.80%±0.04%，較缺氧/復氧組比較，給予缺氧/復氧后的PC12細胞自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(20 nmol/L)處理后，Baf A1能夠顯著降低缺氧/復氧誘導的PC12細胞凋亡水平，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 流式檢測Baf A1處理后各組PC12細胞凋亡變化

2.5α-LA激活mTOR通路的磷酸化水平 如圖4的Western印跡結果顯示：與正常組比較，缺氧/復氧組p-mTOR的水平顯著降低，當給予α-LA處理后能夠顯著升高p-mTOR水平,差異有統計學意義(P<0.05)，提示α-LA抑制缺氧/復氧誘導的異常自噬水平可能是通過激活p-mTOR水平進而達到抑制自噬的作用。見圖4和表1。

1～3：正常組、缺氧/復氧組、缺氧/復氧+α-LA組

3 討 論

缺血性腦卒中患者在溶栓治療后經常伴隨出現神經細胞缺血再灌注損傷并加劇患者病灶及病情〔13，14〕。溶栓治療后減少再灌注損傷誘導的神經細胞凋亡或壞死具有重要意義。

自噬是真核細胞內一個高度保守的生理代謝過程〔15〕。正常生理狀態下，自噬維持在低水平以維持細胞的內環境穩態，在外源性應激、饑餓等刺激條件下自噬被誘導至較高的水平〔16，17〕。細胞內自噬水平的異常調控會導致一系列疾病的發生，比如癌癥、肌肉疾病、代謝疾病、感染和神經退行性疾病等〔18～20〕。研究證實自噬是一個具有雙重作用的生理過程，對維持細胞內環境穩態具有積極作用，異常細胞自噬調控過程又會導致機體細胞出現“自噬性的死亡”〔21〕。但是，其在缺血再灌注損傷過程中的病理分子機制尚不清楚，有待深入研究。

本研究結果證明自噬水平的增加也伴著細胞凋亡水平的升高。α-LA具有抗氧化性，清除自由基的能力，對神經退行性疾病具有保護作用。有研究報道α-LA能有效改善急性缺血性腦卒中患者的病癥，但其潛在分子機制有待闡釋〔9〕。本研究結果發現α-LA能有效降低缺血再灌注誘導的PC12細胞自噬和凋亡水平。體現在自噬標志分子LC3-Ⅱ/Ⅰ的比率降低和凋亡蛋白Bax、酶切casepase-3表達減少。

綜上，我們推測α-LA通過抑制缺血再灌注誘導的過度自噬進而減少過度自噬誘導的細胞凋亡。其發揮保護功能的可能分子機制是激活mTOR的磷酸化降低自噬水平進而抑制過度自噬誘導的細胞凋亡。