不同菌量感染大鼠尿路對尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白表達水平的影響

金海 袁文常 詹鈾超 方容 伍慧妍 彭亮

(廣州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 510700；2金域檢驗學(xué)院)

尿路感染是臨床常見的感染性疾病，可由多種病原體引起，其中80%患者均由尿路致病性大腸埃希菌(UPEC)感染引起〔1〕。UPEC具有特殊的結(jié)構(gòu)如菌毛、鞭毛及分泌毒力因子決定了其致病能力，黏附宿主上皮細胞的能力是致病性的最重要因素〔2〕。另外有證據(jù)表明UPEC菌量也是尿路感染的重要條件，高劑量的細菌可破壞膀胱本身的防御，大大提髙感染的成功率〔3〕。Yang等〔4〕認為細胞毒性壞死因子(CNF1)能夠下調(diào)巨噬細胞CD36的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)急性尿路感染炎癥反應(yīng)，CNF1與CD36蛋白與尿路感染密切相關(guān)。目前尿路感染主要以藥物治療，這些藥物主要針對細菌附著、細菌毒素和蛋白酶、鐵載體、脲酶、菌毛為靶標〔5〕，抗生素為主的治療藥物具有耐藥、副作用大等局限性，因此為研發(fā)新型有效的藥物開展相關(guān)尿道感染發(fā)病機制研究具有重要的意義。本實驗通過建立大鼠尿道感染模型，旨在觀察不同菌量感染大鼠尿道對尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白表達水平的影響，了解菌量與CNF1蛋白和CD36蛋白之間的聯(lián)系，初步探討尿道感染的可能致病機制，為今后研究UPEC的尿道感染診治提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料 實驗大鼠及菌種：6～8周齡雌性SD大鼠50只，體重為(200±10)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘)2020-0001，實驗符合動物倫理委員會的標準。大腸埃希菌ATCC 25922菌株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC。

主要實驗試劑：無水乙醇和二甲苯均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、電鏡固定液、乙二胺四乙酸(ETDA)抗原修復(fù)液均購自谷歌生物科技有限公司，PCR引物由中國廣州銳博生物科技有限公司合成，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，總RNA提取試劑盒購自中國北京百泰克生物技術(shù)有限公司，蘇木素購自美國Sigma-Aldrich公司。

主要實驗儀器：石蠟病理切片機(型號：RM2016)和超薄切片機(型號：UC7)均購自上海鐵卡儀器有限公司，移液槍(型號：KE0003087)購自Dragon公司，電子顯微鏡(型號：Tecnai G220 TWIN)購自美國FEI公司，光學(xué)顯微鏡(型號：TS2)購自日本寧康生物公司。逆轉(zhuǎn)錄擴增儀購自美國Bio-Rad公司，實時熒光定量PCR儀(型號：7500)購自美國ABI公司，紫外分光光度計(型號：Nano Photometer)購自德國Implen公司。臺式高速離心機購自美國Eppendorf Centrifuge公司，組織勻漿儀購自北京柏萊斯特科技有限公司，凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2菌種復(fù)蘇和計數(shù) 取凍存的菌株接種于LB培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，取單個菌落接種于液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)18 h作為計數(shù)的菌種。將上述培養(yǎng)的菌液用生理鹽水按101、102、103、104倍數(shù)進行稀釋，用無菌培養(yǎng)皿分別裝1 ml上述濃度菌液，在培養(yǎng)皿中加入9 ml無菌固體培養(yǎng)基混勻，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進行細胞計數(shù)，以菌落數(shù)接近于100為準，計算每毫升的菌落數(shù)。

1.3尿道感染模型建立及分組 隨機選取10只大鼠用作空白對照(對照組)，40只用于建立尿道感染模型，模型建立參照參考文獻〔6〕：SD大鼠禁水過夜后以水合氯醛深度麻醉，在生物安全柜內(nèi)用酒精消毒尿道口，使用硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道進入約3 cm到達膀胱，排空膀胱內(nèi)殘留尿液，將配好的不同梯次的UPCE菌液注入膀胱，其中菌量分別為101CFU(101CFU組)、102CFU(102CFU組)、103CFU(103CFU組)和104CFU(104CFU組)，注入后用回形針夾住尿道口2～3 h后松開尿道。感染5 d后，測定各組大鼠的相關(guān)指標。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠尿道上皮組織與尿液細菌定量 取大鼠感染5 d后尿液，用直接稀釋涂板定量方法來測定大鼠尿液細菌含量。在無菌操作環(huán)境中取大鼠中斷尿道上皮組織1 g，加入1 ml生理鹽水置入研磨器中，研磨成漿后用101、102、103、104倍數(shù)生理鹽水進行稀釋，分別取上述經(jīng)不同倍數(shù)生理鹽水稀釋后的菌液各1 ml放入無菌平皿中，向各平皿中加入冷卻至45℃的無菌培養(yǎng)基9 ml，使培養(yǎng)基與菌液混勻，待凝固后，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，計算細菌菌落數(shù)。

1.4.2qRT-PCR 檢測大鼠尿道上皮組織CNF1、CD36 mRNA相對表達量 在無菌操作環(huán)境中，取1 g大鼠中段尿道上皮組織用研磨器研磨成勻漿，再用裂解液裂解組織，采用 Trizol 法提取組織總 RNA，將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)置反應(yīng)條件如下：37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))，4℃ 15 min(穩(wěn)定)。qRT-PCR 檢測CNF1、CD36 mRNA相對表達量。PCR程序如下：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 40 個循環(huán)，結(jié)果以 2-ΔΔCt法表示。CNF1、CD36及內(nèi)參GAPDH的引物序列如下：CNF1上 游引物5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′，下 游引物5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3；CD36上游引物5′-ATGAGACTGGGACCATCGGC-3′，下 游引物5′-CAACAAACATCACTACTCCAACACC-3′；GAPDH上游引物5′-CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3′，下 游引物5′-GCCCAGGATGCCCTTTAGTG-3′。

1.4.3Western印跡檢測大鼠尿道上皮組織CNF1、CD36蛋白相對表達量 在無菌操作環(huán)境中，取1 g大鼠中段尿道上皮組織用研磨器研磨成勻漿，再用裂解液裂解組織，提取組織總蛋白，使用 BCA 蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量，按比例加入 4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用TBST洗膜5 min，共 3 次，加入到 2%牛血清白蛋白(BSA)(TBS 配制)封閉液中進行封閉，室溫搖床孵育 2 h。洗膜后先后加入一抗工作液和二抗工作液進行一抗孵育和二抗孵育。將新鮮配制的電化學(xué)發(fā)光(ECL)液滴加到 PVDF膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，采集圖像并分析。蛋白定量：以相對光密度值代表蛋白表達量，以 GAPDH 為內(nèi)參進行分析，實驗至少重復(fù)3次。利用 Western印跡檢測CNF1、CD36蛋白相對表達水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗、Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.1不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織與尿液菌量的影響 各組尿道上皮組織和尿液菌量均有明顯差異(均P<0.05)，且尿道上皮組織和尿液菌量在101CFU組、102CFU組、103CFU組、104CFU組中依次升高，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

表1 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織與尿液菌量的影響

2.2不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1 mRNA和CD36 mRNA表達水平的影響 對照組、101CFU組、102CFU組、103CFU組和104CFU組中，CNF1 mRNA蛋白表達水平依次升高，CD36 mRNA蛋白表達水平依次降低，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

表2 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1 mRNA和CD36 mRNA表達水平的影響

2.3不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1和CD36蛋白表達水平的影響 對照組、101CFU組、102CFU組、103CFU組和104CFU組中，CNF1蛋白表達水平依次升高，CD36蛋白表達水平依次降低，兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western印跡檢測CNF1、CD36蛋白表達

表3 不同菌量感染對大鼠尿道上皮組織CNF1和CD36蛋白表達水平的影響

2.4大鼠尿道上皮組織和尿液菌量與CNF1和CD36蛋白表達相關(guān)性 尿道上皮組織菌量與CNF1蛋白及其mRNA呈正相關(guān)(r=0.861，0.835；P=0.000)；尿道上皮組織菌量與CD36蛋白及其mRNA呈負相關(guān)(r=-0.808，-0.887；P=0.000)；尿液菌量與CNF1蛋白及其mRNA呈正相關(guān)(r=0.854，0.842；P=0.000)；尿道上皮組織菌量與CD36蛋白及其mRNA呈負相關(guān)(r=-0.825，-0.885；P=0.000)。結(jié)果提示尿道上皮組織和尿液菌量與CNF1表達呈正相關(guān)，與CD36表達呈負相關(guān)。

3 討 論

大腸埃希菌ATCC 25922菌株是臨床尿路感染患者體內(nèi)分離株，具有較高的致病能力，此外大腸埃希菌ATCC菌株毒力特點和基因組的相關(guān)基礎(chǔ)研究豐富〔7～9〕，代表性較強，因此本實驗使用其作為尿路模型感染的病原體。在實驗建模過程中，為減少手術(shù)創(chuàng)傷及其他病原體感染腹腔影響本次實驗結(jié)果，在嚴格無菌的環(huán)境采用無創(chuàng)方法，用導(dǎo)管插入尿道直接膀胱灌注培養(yǎng)的菌液，很大程度上減少組織炎癥反應(yīng)，而且操作簡單。毛鑫等〔6〕研究認為建模3 d后大鼠尿路感染模型的感染程度最高，而預(yù)實驗中利用同樣的方法建模時顯示尿路含菌量在感染5 d后達到高峰，結(jié)果差異可能是由于選用的動物品種、動物年齡及大腸埃希菌菌株不同造成的。建模5 d后，建模各組的大鼠尿道上皮組織及尿液均檢測到UPEC，結(jié)果提示兩者菌量高低與UPEC感染量相關(guān)。

許多病原菌對宿主三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白產(chǎn)生毒力因子，特別是Rho家族的小GTPas1和GTPas2。在活性GTP結(jié)合構(gòu)象和非活性二磷酸鳥苷(GDP)結(jié)合構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換中，Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)對調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架和其他細胞功能具有重要的作用，如細胞周期、極性、遷移、胞質(zhì)分裂、增殖、凋亡和存活〔10〕。病原菌通過激活或抑制Rho-GTPase的功能，破壞宿主上皮屏障〔11〕。CNF1是UPEC產(chǎn)生的一種毒素蛋白，其可通過誘導(dǎo)谷氨酰胺去酰胺作用激活宿主真核細胞中Rho家族的小GTPase，從而干擾多種細胞功能〔12〕。此外還有研究顯示CNF1通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用與上皮細胞表面結(jié)合后被內(nèi)化，CNF1在干擾宿主細胞周期中起著重要作用〔13〕。在高血壓性視網(wǎng)膜病變大鼠模型中，抑制CNF1產(chǎn)生可減輕視網(wǎng)膜膠質(zhì)增生并改善視覺表現(xiàn)〔14〕。有報道指出抗溶血素和CNF1的抗體可減輕產(chǎn)毒性尿致病性大腸桿菌尿路感染小鼠的膀胱炎癥〔15〕；大腸桿菌α-溶血素可對抗Rho-GTPase激活毒素CNF1在菌血癥期間引發(fā)的抗毒性天然免疫反應(yīng)〔16〕?；谝陨涎芯靠芍?，CNF1激活Rho-GTPase的功能，從而破壞宿主上皮屏障引起尿路感染。本實驗結(jié)果符合高菌量產(chǎn)生高毒素蛋白的理論，結(jié)果證實了UPEC感染量可直接影響CNF1的表達。CD36是一種重要的清道夫受體，負責(zé)清除病原菌和凋亡細胞，在宿主免疫防御和體內(nèi)平衡中發(fā)揮重要作用〔17〕。研究顯示，炎癥與CD36作用高度相關(guān)，CD36可在炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)下加重腎臟損傷作〔18,19〕，CD36表達異常易造成尿路感染〔4,20〕。實驗結(jié)果體現(xiàn)出了CNF1下調(diào)CD36表達的結(jié)果〔4,20〕。

綜上所述，感染大鼠尿路菌量越高，其尿道上皮組織菌量、尿液菌量和CNF1表達越高，CD36表達越低，尿道感染可能與高菌量影響CNF1和CD36表達相關(guān)。