Klotho RNA干擾對人主動脈平滑肌細胞鈣化和表型轉化的影響

魏建行 梁荃 黃仕瓊 李利華

(大理大學第一附屬醫院老年病科，云南 大理 671000)

心血管疾病導致的死亡約占中國人口死亡的40%以上，而高血壓是心血管疾病最重要的危險因素，約有43%的心血管疾病發病可歸因于高血壓〔1，2〕。動脈硬化是高血壓的發病基礎，是與年齡相關的病理生理學過程，可以影響整個心血管系統的穩態。抗衰老因子(Klotho)是Kuro-O等〔3〕發現的一種抗衰老蛋白，主要表達于腎遠曲小管和大腦脈絡膜中。隨著年齡增加，Klotho表達減少。Klotho基因敲除小鼠可出現多種與衰老相關的疾病，如動脈硬化、不育、皮膚萎縮、骨質疏松及肺氣腫等〔3，4〕；而Klotho過表達則可通過胰島素/胰島素樣生長因子(IGF)1途徑延長壽命〔5〕。Klotho隨著年齡增加表達減少可能在動脈硬化及高血壓、腎臟疾病等發病中起重要作用〔6～9〕。然而，Klotho表達減少加速年齡相關的動脈硬化的機制尚不完全清楚。動脈鈣化主要發生在中膜，在老年人中非常普遍，動脈鈣化可加重動脈硬化，使動脈彈性下降。本研究通過用慢病毒體外干擾人主動脈平滑肌細胞(HA-VSMC)中Klotho的表達，旨在探討Klotho表達降低對細胞鈣化和表型轉化的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 HA-VSMC購于北納生物公司，慢病毒購于上海吉瑪基因，PCR引物購于上海生工生物工程有限公司，Klotho抗體購于Abcam，骨橋蛋白(OPN)購于Elabscience公司，鈣離子檢測試劑購于Elabscience公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞的培養及慢病毒轉染 用含有15%FBS的高糖DMEM培養基培養HA-VSMC。用慢病毒shRNA干擾Klotho的表達。Klotho-2073 shRNA(shKlotho-2073)靶點序列為5′-GAGCCGTATACAAGGAATATG-3′；Klotho-1021 shRNA(shKlotho-1021)靶點序列為5′-CCGAGAGCATGAAGAATAACC-3′；Klotho-1207 shRNA(shKlotho-1207)靶點序列為5′-GGATTGACCTTGAATTTAACC-3′；陰性對照shRNA-NC(shNC組)靶點序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。以3×105個/孔鋪板細胞，慢病毒同時加入1 μg/ml的聚丁二烯72 h后，篩選出最適感染復數(MOI)=20時干擾效率最強，病毒液用于實驗。

1.2.2Realtime PCR 提取RNA，測定濃度并逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，進行Realtime PCR擴增，并檢測Klotho、OPN、α-平滑肌肌動蛋白(SMA)、平滑肌(SM)22α mRNA的相對表達量，以2-ΔΔCt值表示。基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3Western印跡檢測Klotho蛋白的表達 使用慢病毒轉染HA-VSMC 72 h后，提取并測定總蛋白濃度，進行凝膠電泳分離，采用半干轉法轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5%脫脂牛奶封閉液中室溫搖床上封閉1 h后，加入抗微管蛋白(1∶500)、Klotho(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次(15 min/次)后，加入相應二抗(1∶10 000)，搖床室溫孵育2 h。再TBST洗膜3次(15 min/次)，加入親光辣根過氧化物酶(Pro-light HRP)化學發光檢測試劑，使用Bio-Rad凝膠成像系統顯影，使用Image-pro plus灰度值分析。以Tubulin為內參計算Klotho蛋白水平的相對表達量。

1.2.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定人OPN 慢病毒轉染HA-VSMC并培養72 h后，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)反復凍融，致使細胞破碎，離心并收集上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，繪制標準曲線并測定OPN含量。

1.2.5微量法測定鈣離子(Ca2+)和堿性磷酸酶(ALP)活性 采用細胞裂解液進行檢測，按說明書方法操作。

1.3統計分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1RNA干擾抑制HA-VSMC Klotho表達 用慢病毒轉染HA-VSMC 72 h后，熒光顯微鏡和熒光定量PCR證明shKlotho-2073顯著抑制Klotho的表達，抑制效率為86.4%。見表1、圖1。

表1 不同shRNA 的 Klotho 干擾效率比較

圖1 熒光顯微鏡下觀察不同shRNA對HA-VSMC的干擾效果(×100)

因此，選擇shKlotho-2073作為干擾載體。通過Western印跡進一步證實Klotho蛋白表達被顯著抑制〔shNC(0.446±0.025)vs shKlotho(0.303±0.025);P<0.05〕。見圖2。

圖2 Western印跡檢測Klotho蛋白表達

2.2HA-VSMC表型轉化 shKlotho干擾后α-SMA和SM22α相對表達量均顯著增加(P<0.05)。OPN mRNA及蛋白水平也顯著增加(P<0.05)。見表2。

2.3HA-VSMC鈣化檢測 相對于shNC組，shKlotho干擾后細胞內Ca2+水平明顯增加，ALP活性明顯增加(P<0.05)。見表2。

表2 shKlotho干擾后SM22α、α-SMA、OPEN mRNA、OPEN蛋白、Ca2+及ALP比較

3 討 論

在分子水平，與年齡相關的動脈壁結構變化特征包括血管平滑肌細胞的成骨轉化及收縮表型的喪失，成骨細胞分化的轉錄調節因子(如Runx2)的上調，骨細胞標志物(ALP、OPN、骨鈣素)釋放增加，細胞凋亡增加及細胞外基質降解等〔10，11〕。上述的這些持續改變是血管鈣化、動脈硬化和動脈血管重構的基礎。血管鈣化和動脈僵硬增加是血管衰老的標志，甚至已被作為衡量心血管年齡的指標〔12〕。最近研究表明，Klotho的缺失主要參與動脈中膜鈣化的發展。Hu等〔13〕研究結果顯示，與野生型慢性腎臟病(CKD)小鼠相比，過表達Klotho的CKD小鼠可降低血管鈣化的發生發展。然而，患有CKD的小鼠Klotho基因缺陷可發展為嚴重鈣化和腎功能進一步惡化〔16〕。少數臨床研究也提示Klotho水平降低是維持性血透患者主動脈鈣化的危險因素〔14，15〕。Lim等〔13〕最早發現血管平滑肌細胞中存在內源性Klotho表達。血管平滑肌細胞中Klotho低表達可消除成纖維細胞生長因子(FGF)23介導的細胞內信號轉導，并加速血管平滑肌細胞鈣化的發展〔13〕。本研究通過RNA干擾技術，證實在HA-VSMC中Klotho低表達可通過促進ALP活性，增加細胞內鈣離子水平，加重細胞鈣化和細胞表型從收縮型向分泌型轉化。本研究結果有助于深入了解衰老或其他危險因素導致Klotho表達減少導致動脈硬化的機制。

血管平滑肌細胞存在收縮型和分泌型。在正常情況下，血管平滑肌細胞通過收縮表型維持主動脈壁的彈性，當受到生化信號或機械刺激時轉化為分泌型，致使動脈彈性下降，主動脈壁僵硬。血管平滑肌細胞的表型轉化也是心血管疾病發生發展的關鍵因素，尤其是在高血壓、冠狀動脈疾病和介入后再狹窄等心血管疾病的發病中具有重要作用〔17〕。當血管受損或生長因子刺激體外培養的血管平滑肌細胞時，血管平滑肌細胞通過改變基因的表達，由收縮表型轉化為分泌型〔18〕。Lim等〔16〕研究發現血管平滑肌細胞中Klotho缺乏會導致收縮表型的喪失。因此，血管平滑肌細胞從收縮型轉變為分泌型與Klotho缺乏有關，且進一步研究表明內源性Klotho表達僅存在于具有收縮表型的血管平滑肌細胞中。血管平滑肌細胞從收縮型向分泌型轉化的過程由心肌素(Myocardin)協助，它是轉錄因子SRF的輔助因子，結合于CArG-box序列，調節平滑肌細胞收縮基因的轉錄，包括α-SMA/SM22α〔19〕。本研究結果進一步提供了抗衰因子Klotho表達減少參與細胞鈣化及表型轉化的證據，具有重要的科學意義。

總之，人主動脈血管平滑肌細胞Klotho表達減少可促進細胞鈣化和表型轉化，可能在動脈鈣化中發揮重要作用。抗衰老因子Klotho可作為防治動脈硬化的一個新的干預靶點。