谷氨酸誘導大鼠結腸 Cajal 間質細胞構建自噬模型

顏帥 樂音子 王曉鵬

(南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州 215009)

胃腸道 Cajal間質細胞(ICC)是胃腸道慢波活動的起搏細胞，在調控胃腸道的運動中扮演重要角色，研究表明ICC數量、分布、形態和結構的異常變化與慢傳輸型便秘(STC)發病有密切關系〔1，2〕。而ICC細胞過度自噬是慢傳輸型便秘大鼠模型中ICC數量減少的關鍵，誘發ICC功能障礙，導致STC發生〔3～6〕。既往防治便秘的藥物對ICC的影響多數還停留在整體動物實驗水平，尚缺乏構建結腸 ICC自噬的模型。本研究完善結腸ICC的消化分離培養技術，探討結腸ICC自噬模型的建立，為發展 ICC的新型藥物或者診療手段提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠30只，雌雄不限，體重200 g左右，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK(湘)2016-0002。

1.2實驗儀器 超凈工作臺(北京亞泰YT-CJ-2NB)；低速離心機(知信儀器SL02)；直熱式二氧化碳培養箱(上海三藤儀器DH-160I)；解剖顯微鏡(上海光學儀器一廠XTZ-D/E)；倒置顯微鏡(北京中顯恒業DSZ2000X)；無菌平皿(美國Corning)；200目細胞濾網(BD)；眼科剪刀、鑷子(上海金粒醫療器械有限公司)；搖床、旋渦混合器(江蘇其林貝爾)；精密PH計(雷磁E-201-C)；蓋玻片、載玻片(海門遠泰)；臺式冷凍離心機(中國湖南湘儀H1650R)；電子天平(美國雙杰JJ224BC)；電泳儀、電泳槽、轉膜儀(北京六一)；磁力攪拌器(雷磁JB-13)；生物樣品均質儀(杭州奧盛BioPrep-24)。

1.3實驗試劑 M199培養基(Gbico)；胰酶消化液(美國Ameresco)；RIPA裂解液、青-鏈霉素(上海碧云天)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone)；胎牛血清(Gbico)；Ⅱ型膠原酶(COLLAGENASE)；Ⅰ型鼠尾膠原蛋白(北京索來寶)；L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)；脫氧核糖核酸酶(DNase)Ⅰ(康為世紀)；CCK-8 試劑盒(日本同仁化工)；兔抗大鼠 c-Kit原癌基因蛋白多克隆抗體(abcam)；Tween-20、4%多聚甲醛(上海國藥生物)；微管相關蛋白輕鏈(LC)3B抗體(美國proteintech)；β-actin(美國proteintech)；羊抗鼠IgG(美國proteintech)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(中國大連美倫MB2479)；超敏化學發光液(美國advansta)；顯影液、定影液(上海佳信)；甘氨酸、甲叉雙丙烯酰胺(美國Sigma)。

1.4原代培養大鼠結腸ICC 細胞分離用的眼科剪刀、鑷子等器械經121℃高溫高壓滅菌30 min取出，160℃烘干，泡新潔爾滅液5 min再泡75%酒精5 min，放于超凈工作臺紫外殺菌30 min。參照文獻〔7，8〕進行優化，取SD大鼠，雌雄不限，禁食12 h，脫頸處死，全身快速浸泡于75%酒精3 min，快速取出置于超凈臺上；縱行切口剖開腹腔，取自盲腸后2 cm起的近端結腸直至距肛門2 cm的直腸，放入直徑10 cm的細胞培養皿，用含2%雙抗的PBS將腸內容物沖洗干凈；解剖顯微鏡下眼科鑷仔細剝去腸系膜和血管，剪碎至1～2 mm3小塊，放入15 ml離心管內，加入Ⅱ型膠原酶消化液7 ml(pH7.0，含1.3 mg/ml Ⅱ型膠原酶)，37℃，充分消化3 h，間隔30 min取出吹打1次；加入等體積的完全培養基終止消化，200目篩過濾后經1 200 r/min離心3 min，棄去上清液；加入完全培養基使細胞重懸；再將細胞濃度調整至1×106/ml，接種至預先包被鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(2.5 μg/ml)的60 mm培養皿，放入37℃、5% CO2培養箱內培養。細胞培養72 h后換液，洗去未貼壁細胞，再加入新的培養基繼續培養，以后每天換液1次，期間連續用倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態變化。

1.5結腸ICC的免疫熒光鑒定 取對數生長期細胞，經冰凍甲醇固定10 min，5%脫脂奶粉封閉10 min；加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗體(1∶100)，4℃冰箱孵育過夜，PBST 液沖洗3遍，加入Ⅱ 抗(Dylight488結合山羊抗兔IgG，1∶200)，37℃培養箱避光孵育1 h，PBST清洗3遍，最后加抗淬滅封片液封片，置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6CCK-8法檢測不同濃度和時間谷氨酸對原代結腸ICC活力的影響 取對數生長期的大鼠結腸ICC細胞，重懸計數后接種于3個96孔板，20孔/板，共60個孔，每孔100 μl細胞懸液，每孔約5×103個細胞，24 h后換液待其貼壁后加藥，分別給予谷氨酸0.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L處理大鼠結腸ICC細胞，記為空白組、谷氨酸A組、谷氨酸B組、谷氨酸C組，分別培養3、6、24 h。各組加藥培養到預定時間后分別加入10 μl CCK-8，37℃，5%CO2繼續孵育4 h 后，Bio-Tek酶標儀450 nm處為吸光度(OD)值檢測波長。

1.7Western印跡檢測不同時間點不同濃度谷氨酸對LC3蛋白表達的影響 取對數生長期的大鼠結腸ICC細胞，經胰酶消化離心后計數，并接種 2×105個細胞至 25 cm2的細胞培養瓶中，貼壁24 h后，更換新的培養基；并給不同濃度谷氨酸分別干預 3 h、6 h 和 24 h 后，分組同1.6部分。蛋白提取：用冰預冷PBS洗滌細胞1次，加入200 μl RIPA裂解液，用細胞刮刀刮下細胞，收集懸液，超聲破碎1.5 min；冰上裂解10 min；4℃，12 000 r/min離心15 min。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。取120 μl蛋白上清，加入30 μl 5×上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。根據蛋白定量的結果，第一孔點入marker 2 μl，依次上樣10 μl已變性蛋白。開始電泳，電泳恒定電壓75 V，時間為130 min。待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。轉膜：分別切膠LC3B(16～18 kD)，β-actin(42 KD)。準備6張與膠同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜(NC)膜，NC膜與濾紙一起放入轉膜緩沖液中，至完全浸透。蓋上儀器，接通電源，轉膜300 mA恒定電流，LC3B約35 min，β-actin約60 min。轉膜完畢后，將膜取出放入1×磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)中洗1次。5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫放置60 min，4℃過夜，次日室溫放置30 min。加入抗LC3 抗體(1∶600)及抗內參照 β-actin抗體(1∶5 000)，洗3次，每次15 min。加入稀釋HRP標記的二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h，洗膜3 次，每次10 min。使用ECL化學發光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內與X膠片曝光15 min；顯影沖洗。

1.8透射電鏡檢測谷氨酸誘導后 ICCs 的自噬體和超微結構的變化 取對數生長期的大鼠結腸ICC細胞，經胰酶消化離心后計數接種至6孔板中，每孔接種1×106的細胞量，貼壁24 h后，加入中濃度谷氨酸與ICCs作用3 h后，經預冷PBS洗滌3次，每次3 min。使用胰蛋白酶消化細胞并收集離心去上清，細胞固定到2.5%戊二醛6～12 h，把固定液棄掉，細胞放入PBS緩沖液中，入1%鋨酸后固定1～2 h；乙醇逐級脫水，純環氧樹脂包埋后入40℃烤箱烘烤12 h，取出包埋塊修塊后超薄切片；銅網撈片，電子染色(鉛、鈾染色)；日立7700型透射電鏡觀察和攝圖。

1.9統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差齊性檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1免疫熒光鑒定大鼠結腸ICC細胞 如圖1所示，普通顯微鏡和熒光顯微鏡下大鼠結腸ICC細胞胞體呈菱形或三角形，細胞核大，核周胞質較少，細胞胞體以 2 個以上長突起為多見，突起間相互連接并與周圍細胞緊密相連(圖1A)；熒光顯微鏡下 c-Kit 蛋白呈陽性表達，胞體明顯著色，呈綠色陽性顯色(圖1B～1D)；核染信號圖(圖1E)顯示藍色為核染信號。

A：ICC細胞倒置顯微鏡下形態學表現(×40)；B：ICC細胞免疫熒光下c-Kit染色(×100)；C：DAPI染色(×100)；D：c-Kit染色(×400)；E：DAPI染色(×400)；F：融合染色(×400)

2.2不同時間不同濃度谷氨酸對結腸ICC活性的影響 培養3 h時，各組ICC細胞活力差異無統計學意義(P>0.05)；培養6 h時，谷氨酸B、C組ICC細胞活力顯著低于空白組(P<0.05)；培養6 h時，谷氨酸A、B、C組ICC細胞活力均顯著低于空白組(P<0.05，P<0.01);5.0 mmol/L谷氨酸培養細胞24 h時，細胞活力最低，細胞抑制率最高。見表1。

表1 各組培養不同時間對大鼠結腸 ICC細胞活力的影響及細胞抑制率比較

2.3不同時間點不同濃度谷氨酸對ICC的LC3蛋白表達的影響 與空白組比較，培養6 h時谷氨酸B組和培養24 h時谷氨酸B、C組均可顯著提高自噬蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P<0.05,P<0.01)；與6 h比較，24 h谷氨酸B組、C組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高(P<0.05)，提示隨著作用時間的增加，細胞自噬活性相對升高，見表2、圖2。

表2 各組培養不同時間點不同濃度谷氨酸LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

1～4：空白組、谷氨酸A組、谷氨酸B組、谷氨酸C組

2.4結腸ICC細胞內自噬體和超微結構的變化 如圖3所示，空白組結腸ICC內可見豐富的線粒體和內質網等細胞器，未見明顯的自噬體或自噬溶酶體；谷氨酸B組細胞器減少，內質網管腔擴張，粗面型內質網脫顆粒明顯，可見明顯自噬泡(紅色箭頭為初始自噬泡，藍色箭頭為降解自噬泡)和大量自噬體。

圖3 透射電鏡下Cajal細胞內超微結構(×400)

3 討 論

谷氨酸在介導神經遞質傳遞和多種蛋白質合成過程中起關鍵性作用，過量的谷氨酸因其毒性驟增引起氧化應激的損傷誘導神經元細胞發生程序性死亡〔9〕。研究表明間質細胞的丟失與腸道運動障礙有關，在胃腸動力障礙的結腸炎模型大鼠 ICC 中出現過度自噬現象〔10〕。基于上述依據，本研究應用過量的谷氨酸模擬外界不良應激誘導離體結腸ICCs 產生自噬從而構建大鼠結腸ICC自噬模型。

本實驗以不同濃度的谷氨酸作用于體外培養的 SD 大鼠結腸ICC，CCK-8 實驗結果表明不同時間點不同濃度谷氨酸均可降低結腸ICC的活力，且以24 h時5 mmol/L谷氨酸效果最優。為繼續驗證谷氨酸在此濃度及時間下的作用效果，通過Western印跡和透射電鏡觀察，顯示谷氨酸C2組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值最高，透射電鏡出現明顯的自噬泡，細胞質內空泡增多，細胞器減少，與周圍神經突觸關系網接觸消失，超微結構中的線粒體受損，提示本實驗成功誘導結腸ICC的自噬。自噬過程是由一系列自噬相關蛋白介導完成的，LC3是自噬體膜上的標記蛋白，其存在有兩種形式即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，通過 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值可反映自噬水平，作為評估細胞自噬強弱的重要依據〔11〕。與本研究不同，譚人千等〔12〕通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值結合免疫熒光和透射電鏡技術成功篩選到谷氨酸誘導大鼠胃 ICCs 自噬的最佳作用濃度和時間分別為5 mmol/L和 3 h。這可能由于機體不同位置的ICC有不同特性：發生應激性反應初期，產生受損的亞細胞器、錯誤折疊蛋白等較少，隨著時間的推移ICC自噬活性逐漸增加有關。

綜上，谷氨酸可以誘導大鼠結腸ICC自噬，其最佳作用濃度和刺激時間分別為 5 mmol/L 和 24 h，為進一步研究結腸ICC功能狀態，在增殖、凋亡、表型轉化和自噬相關通路的mRNA和蛋白研究提供可靠的細胞模型，利于今后進一步篩選腸道藥物靶點。