超聲法提取梅花鹿茸總多肽及其抗炎活性

張維 于珊珊 尹宏兵

(1長春中醫(yī)藥大學附屬第三臨床醫(yī)院，吉林 長春 130000；2長春中醫(yī)藥大學 吉林省人參科學研究院)

鹿茸是雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，是一種特殊的軟骨組織，含有多種活性因子，是鹿體在骨化之前貯存生長因子最活躍的生長點。鹿茸多肽是鹿茸主要的生物活性成分物質，對成骨細胞、造血細胞、纖維細胞、上皮細胞生長及神經(jīng)生長都有明顯的促進作用。本研究探討超聲破碎法提取梅花鹿茸總多肽的效果及鹿茸總多肽的抗炎活性，為今后鹿茸總多肽的研究奠定基礎，同時對于后續(xù)研究梅花鹿茸總多肽對炎癥細胞的毒性作用的實驗研究具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1鹿茸總多肽的超聲波提取制備方法

1.1.1超聲破碎時間對鹿茸總多肽提取的影響 稱取新鮮的梅花鹿茸約20 g，剁成小塊后放入燒杯中，用預先放于層析柜(4℃)冷卻過的蒸餾水沖洗數(shù)次，直至完全無血色；粉碎機粉碎，加入預冷的勻漿液(pH3.5的冰醋酸水溶液)50 ml加入一定量的玻璃珠，置于4℃低溫搖床中6 h后，冰浴條件下超聲破碎(工作5 s,停止3 s)，于超聲破碎的不同時間(0,10,20,30，40,50,60,80 min時)，吸取混合溶液1 ml,于4℃，10 000 r/min離心15 min后吸取上清液，保存于4℃中，測定蛋白濃度。

1.1.2制備鹿茸總多肽 稱取新鮮的梅花鹿茸200 g，按照上述的操作方法，加入預冷的勻漿液500 ml，放于4℃的恒溫搖床中6 h后，冰浴條件下超聲破碎，待超聲結束后，于4℃，10 000 r/min離心15 min，合并上清液，冷凍干燥獲得粉末。稱取20 mg凍干粉，溶解于1 ml的pH3.5的冰醋酸水溶液中，脫鹽后，保存于-20℃中待用。

1.2應用Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳(SDS-PAGE)方法鑒定鹿茸總多肽

1.2.1溶液配制及膠制作 陰極緩沖液由三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.1 mol/L，Tricine 0.1 mol/L和SDS 1 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/g的HCl調節(jié)pH為8.25。陽極緩沖液由Tris 0.2 mol/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl調節(jié)pH為8.9。膠緩沖液由Tris 3.0 mol/L和SDS 3 g/L配制而成，配制好的溶液用1 mol/L的HCl調節(jié)pH為8.4待用。3C丙烯酰胺貯存液的配制：首先在100 ml純水中溶解 1.5 g N，N′-甲叉雙丙烯酰胺和48.0 g 丙烯酰胺，混勻后，用濾紙過濾待用；6C 丙烯酰胺貯存液的配制是先在100 ml純水中溶解3.0 g N，N′-甲叉雙丙烯酰胺和 46.5 g 丙烯酰胺，之后的處理同3C丙烯酰胺貯存液的配制方法。2×上樣緩沖液是由120 g/L的甘油，4%的SDS，0.1 g/L的溴酚藍組成，100 mmol/L的Tris和20 ml/L巰基乙醇，混合均勻后調節(jié)pH為6.8后待用。脫色液的配制：在900 ml 蒸餾水中加入100 ml 乙酸。染色液的配制：在450 ml 蒸餾水中依次加入2.5 g 考馬斯亮藍 R-250、100 ml 乙酸和450 ml 乙醇。凝膠是由分離膠、間隙膠和濃縮膠組成的三層不連續(xù)的結構。按表1進行Tricine-SDS-PAGE膠的配制。

表1 分離膠、間隙膠和濃縮膠的組成

1.2.2上樣與電泳方法 陽極緩沖液裝于外槽，陰極緩沖液裝于內槽。按1∶1的比例將上樣緩沖液和蛋白質樣品均勻混合，水浴煮沸 5 min。在點樣孔內加入10 μl樣品，在另一點樣孔加入蛋白質標準品10 μl。在恒壓40 V條件下跑約1 h，待樣品進入間隙膠后，將電壓升至70 V，于恒壓條件下跑至電泳結束。

1.2.3染色、脫色和膠的保存方法 電泳后的膠可于染色液中震蕩染色 6～7 h，隨后在脫色液中脫色數(shù)次，直至背景清晰可見，膠的保存可參考一般的SDS-PAGE保存條件。

1.2.4蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白濃度，將200 μl的蛋白溶液加入試管中，再加入5 ml的考馬斯亮藍染色液，渦旋，待反應5 min后，應用紫外分光光度法于波長595 nm處測定吸光度值，根據(jù)考馬斯亮藍標準曲線計算出蛋白濃度。

1.3梅花鹿茸總多肽細胞水平抗炎活性實驗

1.3.1細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞接種在含5% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每天換液，2～3 d傳代一次。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2細胞增殖活性檢測 應用CCK-8比色法檢測細胞增殖活性：首先將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞數(shù)調至4×105個/ml，隨后在96孔培養(yǎng)板中每孔接種100 μl RAW264.7細胞，在37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行孵育，并于2 h后進行培養(yǎng)基的更換。設計模型組、給藥組和空白對照組，每組3個復孔，調零選擇空白孔。空白對照組中只加培養(yǎng)液；模型組需要將終濃度為1 μg/ml的脂多糖(LPS)加入培養(yǎng)液中；同時給藥組設計高，中，低三個給藥濃度，分別在模型組的基礎上加入10 mg/ml、20 mg/ml和30 mg/ml終濃度的梅花鹿茸總多肽(分別為低、中、高劑量組)。各組細胞均培養(yǎng)24 h，每孔在無菌條件下加入10 μl的 CCK-8溶液，于避光條件下孵育4 h后，測定各孔在450 nm波長條件下的OD值。計算細胞相對活性。細胞相對活性=實驗組OD-調零組OD/(對照組OD-調零組OD)。

1.3.3細胞上清液中IL-6和IL-1β的檢測 應用ELISA檢測細胞上清液中IL-6和IL-1β：首先將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞數(shù)調至4×105個/ml，在24孔培養(yǎng)板的每孔中接種500 μl該細胞，在條件為37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育2 h，并隨后更換培養(yǎng)液。分組同1.3.2，各組細胞培養(yǎng)均24 h，于4℃，3 000 r/min離心10 min。各組細胞上清液應用ELISA試劑盒檢測其中的IL-6和IL-1β含量。按照試劑盒說明書嚴格操作。

2 結 果

2.1梅花鹿茸總多肽的超聲波提取分離 超聲0、10、20、30、40、50、60、80 min時，蛋白質濃度分別為：(0.12±0.01)mg/ml、(0.63±0.02)mg/ml、(1.12±0.01)mg/ml、(1.35±0.05)mg/ml、(1.42±0.03)mg/ml、(1.55±0.02)mg/ml、(1.58±0.02)mg/ml、(1.61±0.04)mg/ml；0～40 min，隨著超聲時間的延長，提取到的鹿茸多肽的濃度也在逐漸增大，超聲40～80 min過程中，蛋白質的濃度變化不明顯，因而可以選擇超聲破碎時間為40 min，從而獲得較好的超聲破碎提取鹿茸總多肽的效果。

2.2梅花鹿茸總多肽的 Tricine-SDS-PAGE 初步鑒定 由圖1可以看出，梅花鹿茸多肽在電泳膠中呈彌散狀分布，通過與標準蛋白質樣品比對，可知其分子量分布在14.4～3.3 kD。

圖1 梅花鹿茸總多肽的 Tricine-SDS-PAGE

2.3梅花鹿茸總多肽的抗炎活性研究

2.3.1梅花鹿茸總多肽對RAW264.7細胞的毒性實驗 低、中、高劑量組對RAW264.7細胞均無毒害作用，與空白對照組相比，細胞增殖活性差異無統(tǒng)計學意義〔(113.579±1.24)%、(113.137±0.98)%、(115.314±1.19)%、(100.000±0.00%)；P>0.05〕，因此選擇的三種梅花鹿茸總多肽可以用于后續(xù)實驗研究。

2.3.2梅花鹿茸總多肽對LPS誘導RAW264.7細胞 IL-6 的表達影響 模型組IL-6與空白對照組相比明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量組IL-6含量明顯降低(P<0.05)；抑制效果最佳時，其鹿茸總多肽的濃度為30 mg/ml。

2.3.3梅花鹿茸總多肽對RAW264.7細胞IL-1β蛋白的表達影響 與空白對照組相比，模型組IL-1β顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，低、中、高劑量組IL-1β含量顯著下降(P<0.05)，其抑制效果最佳時的梅花鹿茸的濃度為20 mg/ml。見表2。

表2 各組細胞培養(yǎng)基上清中IL-6、IL-1β含量比較

3 討 論

追溯到我國古代，人們已經(jīng)開始對鹿茸的功效進行研究，起初人們只認識到鹿茸能夠強身健體,對提高性功能方面有顯著作用，但隨著現(xiàn)代科學技術日新月異的發(fā)展，已經(jīng)逐漸證實鹿茸含有大量的氨基酸、多肽、蛋白質、無機元素、磷脂等脂類物質和糖類化合物等復雜的化學成分，并具有抗氧化、抗炎作用、提高免疫、促進成骨細胞增殖、預防和治療骨質疏松癥、增強性功能〔1，2〕等廣泛的作用。

鹿茸多肽具有抗炎作用，可降低大鼠腎上腺中膽固醇的含量和抗壞血酸含量，明顯升高血清皮質醇含量，具有顯著的抗炎作用，對各種急慢性炎癥均具有明顯療效。同時研究還發(fā)現(xiàn)即使阻斷垂體后，抗炎作用依然存在，證明鹿茸多肽的抗炎作用機制不完全依賴于垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)〔3〕。有研究表明中成藥中鹿茸口服液和鹿茸膠囊也具有相同的抗炎功效〔4～6〕在治療和預防疾病中被廣泛應用。分離鹿茸多肽的技術也在不斷提高，Zha等〔7〕已成功從梅花鹿茸中分離得到一種多肽，該多肽由68個氨基酸組成且相對分子質量約為7 200 U；周秋麗等〔8〕通過應用電泳分離分析和質譜分離分析等技術手段，證明梅花鹿茸多肽的相對分子質量范圍在1 000～3 000 D；隨著分離技術的不斷提到,目前已有技術可以從梅花鹿茸中分離得到純度高達99%且相對分子質量約為30 000 U的一個單體多肽，張鄭瑤等〔9〕利用氚-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)檢測該單體多肽活性，發(fā)現(xiàn)其有對骨細胞有極顯著的促進增殖作用，尤其是對經(jīng)過原代培養(yǎng)的核軟骨細胞和表皮細胞。梅兵等〔10〕在二杠梅花鹿茸分離得到梅花鹿多肽Ⅰ和Ⅱ，并利用生物效應實驗研究，證明梅花鹿多肽組分Ⅰ和Ⅱ均具有抗炎效果及促進生長作用；Sui等〔11〕研究鹿茸多肽是否具有促進細胞增殖作用，在梅花鹿茸中分離得到一個相對分子質量為1 479.9 U的多肽，并證明該多肽對小鼠HT22細胞有促進增殖的作用；王豐等〔12〕從馬鹿茸中分離得到相對分子質量為3 095.1 U的一種多肽，利用凝膠過濾層析法、離子交換層析法及高效液相等技術手段，表明鹿茸多肽對表皮細胞BRL肝細胞株的增生繁殖有明顯的促進作用。鹿茸的抗炎作用的研究仍處于起步階段，對鹿茸中具有抗炎作用的多肽成分的研究是十分有意義的。本研究結果表明LPS誘導RAW264.7細胞IL-6的高表達能夠被一定濃度的梅花鹿茸總多肽所抑制。

綜上所述，應用超聲破碎法提取鹿茸總多肽可以獲得良好的效果；鹿茸總多肽具有抗炎作用，并在不同濃度下抗炎作用效果不同。為今后進一步臨床藥理實驗研究奠定基礎。