尿激酶原對冠脈結扎大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

劉江波，張金盈，劉志遠，仇瑞莉，張松雨，梅艷陽，趙曉寧，李 綱(.南陽市中心醫院心血管內科，南陽 473009；2.鄭州大學第一附屬醫院心血管內科，鄭州 450052)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指中斷的心肌組織血流恢復正常灌注后，心肌損傷進行性加重的病理過程[1-2]。缺血期可引起心肌超微結構、能量代謝、氧化應激、心肌損傷及線粒體凋亡等一系列損傷性變化，嚴重者會因心律失常而導致猝死[3]。治療MIRI的藥物較多，其中尿激酶原(PRO)屬于第二代溶栓藥，是尿激酶的前體物質，具有纖維蛋白特異性[4]。高海英等[5]研究表明，PRO可明顯改善急性心肌梗死患者的心肌功能，但目前關于其治療MIRI的作用機制尚不完全統一。本文旨在探究PRO對冠脈結扎大鼠心肌缺血血流動力學和MIRI的影響，以期了解PRO對MIRI患者的治療作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；低溫離心機，湖南恒諾離心機有限公司；DW-T6型彩色多普勒超聲儀，江蘇大為醫療有限公司；小動物Medlab生物信號采集系統，南京美易公司；UV-240型紫外分光光度計，日本Shimadzu公司；Bx50F4型光學顯微鏡，日本Olympus公司；全自動生化分析儀，日本 Furuno Electric公司；蛋白電泳及轉膜儀，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統，以色列DNR公司；流式細胞儀，賽默飛世爾科技有限公司；LD-66型實驗室切片機，長沙益廣制藥機械公司。

1.2試藥 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒以及蘇木素、伊紅，均購自武漢博士德生物工程有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)檢測試劑盒,均購自上海恒遠生物科技有限公司；戊巴比妥鈉，中國醫藥集團上海化學試劑公司；FITC標記Annexin V凋亡檢測試劑盒,購自四季青生物工程材料有限公司；Bcl-2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)單克隆抗體,購于美國Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG等二抗，購自美國Thermo公司。

1.3動物 SPF級3周齡SD大鼠60只，購自廣東醫學院實驗動物中心，粵監證字 2015A029。本實驗經動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1分組及建立模型 將60只大鼠適用性喂養 1 周，隨機選15只作為對照組，其余45只大鼠采用冠脈結扎手術制備MIRI模型[6]。給造模大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液50 mg·kg-1麻醉，切開左胸第 2～5肋之間的皮膚，分離皮下組織及前鋸肌和胸大肌后切開第 2～3 肋間肌暴露心臟，結扎，使得心肌細胞缺血，缺血時間為15 min，后灌注10 min，1 h后再次缺血15 min，后灌注10 min，消毒，縫合。動脈結扎后使用心電圖檢測，結果顯示，ST段明顯抬高、T波高聳，持續30 min后打開結扎線，恢復血流灌注，心電圖顯示結扎后ST段逐漸下降、T波逐步恢復視為造模成功。將造模成功的45只大鼠均分為模型組和PRO高、低劑量組(分別靜脈注射2，1 mg·kg-1PRO)，對照組和模型組分別注射等量生理鹽水，每日1次，持續7 d。

2.2檢測項目

2.2.1大鼠血流動力學檢測 完成藥物干預后24 h，采用DW-T6型彩色多普勒超聲儀檢測各組大鼠平均動脈壓(MAP)、左室收縮壓(LVSP)和左心室舒張末壓(LVEDP)水平。

2.2.2大鼠血清炎性因子及氧化應激物質檢測 完成大鼠血流動力學檢測后從頸總動脈插管接取0.5 mL大鼠血液，嚴格按照MDA、SOD、ROS、IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒說明書操作，檢測各成分水平。

2.2.3HE染色觀察大鼠心肌損傷 處死大鼠后，取大鼠心肌組織，用二甲苯浸泡后再用酒精梯度脫水，蘇木精浸泡后用鹽酸酒精分化、氨水沖洗，用伊紅染色，酒精浸泡脫水，中性樹膠封片，在400倍鏡下觀察大鼠的心肌細胞狀態。

2.2.4流式細胞儀檢測大鼠心肌細胞凋亡 將各組大鼠心肌組織剪碎后用胰酶消化制成細胞懸液，離心機在4 ℃恒溫下以3 000 r·min-1離心 5 min，加入Binding Buffer和Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育并加入Binding Buffer后用流式細胞儀檢測。

2.2.5Western Blot法檢測蛋白表達水平 取大鼠心肌組織，用胰蛋白酶消化，提取總蛋白，轉移蛋白到PVDF膜，室溫封閉2 h后加入對應抗體，孵育2 h，以β-actin作為內參蛋白，對比條帶顏色，計算各蛋白的表達水平。

3 結果

3.1大鼠血流動力學檢測結果 見表1。由表1可知，與對照組比較，模型組大鼠MAP和LVSP水平顯著降低，LVEDP顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP水平顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP水平顯著降低(P<0.01)。

3.2大鼠血清炎性因子檢測結果 見表2。由表2可知，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.01)。

表1 大鼠血流動力學檢測結果

表2 大鼠血清炎性因子檢測結果

3.3大鼠氧化應激水平檢測結果 見表3。由表3可知，與對照組比較，模型組大鼠血清MDA和ROS水平顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠血清MDA和ROS水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠血清MDA和ROS水平顯著降低，SOD水平顯著升高(P<0.01)。

表3 大鼠氧化應激水平檢測結果

3.4大鼠心肌損傷HE染色觀察結果 見圖1。由圖1可知，對照組大鼠心肌組織、肌外膜、心肌纖維均正常且完整；模型組大鼠心肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，同時心肌細胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；PRO高、低劑量組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲。

3.5大鼠心肌細胞凋亡檢測結果 見表4和圖2。由表4和圖2可知，與對照組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較

圖1 大鼠心肌損傷HE染色觀察結果(×400)

圖2 大鼠心肌細胞凋亡檢測結果

3.6大鼠凋亡蛋白及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路蛋白檢測結果 見圖3和表5。由圖3和表5可知，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織Bax和磷酸化c-Jun氨基末端激酶 (P-JNK) 蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PRO低劑量組大鼠心肌組織Bax和P-JNK蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與PRO低劑量組比較，PRO高劑量組大鼠心肌組織Bax和P-JNK蛋白表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。

圖3 大鼠凋亡蛋白及JNK信號通路蛋白檢測結果

表5 大鼠凋亡蛋白及JNK信號通路蛋白檢測結果

4 討論

MIRI會導致心律失常，影響血流動力學[7]。本研究發現，與模型組相比，PRO低劑量組大鼠MAP和LVSP水平顯著升高，LVEDP顯著降低，說明PRO可有效改善大鼠MIRI后的血流動力學。這可能是因為PRO含有纖溶酶原激活劑抑制劑的作用位點，可有效抑制缺血后的心臟出現血栓，同時可較好地溶解血凝塊從而改善血流動力學。同時PRO可以通過緩解心臟的損傷，改善心肌的供血能力，從而改善血流動力學。溫且木·阿布都拉等[8]研究表明，PRO可有效緩解大鼠MIRI，改善血流動力學，與本研究結論一致。

MIRI后會發生一系列免疫反應[9]，促炎性細胞因子主要包括TNF-α、IL-1β、IL-6 和白細胞介素-8(IL-8)。其中IL-6和TNF-α由單核細胞、巨噬細胞和非免疫細胞等分泌，是主要的促炎癥因子[10-11]。由本研究結果可知，與模型組比較，使用PRO處理后大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，說明PRO可有效抑制大鼠體內的炎癥反應。這可能是因為PRO可以作用JAK2/STAT3信號通路，通過調節該信號通路調節其下游炎癥因子的分泌，有效緩解大鼠心肌細胞缺血后的炎癥反應。王曉亞[12]研究表明，PRO可有效緩解心肌梗死患者炎癥反應，與本研究結論類似。

心肌細胞缺血后會產生大量的ROS，使得機體發生氧化應激[13]。發生氧化應激后，細胞膜的通透性會改變并使得細胞內酶MDA和ROS大量釋放到血液中[14]。本研究發現，與模型組比較，使用PRO處理后MDA和ROS水平顯著降低。這可能是由于PRO具有抗氧化性，可有效抑制ROS對細胞膜的損傷，防止細胞內酶MDA和ROS大量釋放到血液中。劉志遠等[15]研究表明，PRO可有效緩解大鼠MIRI和氧化應激反應，與本研究結論相一致。

細胞凋亡是MIRI中常見的現象之一，Bcl-2家族是常見的凋亡控制基因[16]。該家族主要包括Bcl-2基因和Bax基因，Bcl-2為抑凋亡基因，Bax為促凋亡基因[17]。研究發現，使用PRO處理后Bcl-2蛋白表達水平顯著升高、Bax蛋白表達水平顯著降低，說明使用PRO處理后大鼠缺血后心肌細胞的凋亡得到緩解。這可能是因為PRO能有效抑制凋亡基因的表達，并促進抗凋亡基因的表達，防止MIRI后的心肌細胞凋亡。羅敏等[18]研究表明，降低MIRI后細胞的凋亡可有效緩解MIRI，與本研究結論類似。

JNK 信號通路調控炎癥反應在MIRI病理過程中起重要的作用[19-20]。研究表明，激活JNK信號通路后會促進白細胞介素-1 (IL-1)和轉化生長因子-β(TGF-β)的表達，激活 TGF-β激酶 1和 Toll 樣受體，使得轉化生長因子激酶(TAK1)被激活，最終反作用于JNK 通路，使之激活。本研究發現，使用PRO處理后，大鼠心肌組織P-JNK蛋白表達水平顯著降低。說明PRO可有效抑制JNK信號通路，并通過JNK信號通路抑制下游的炎癥反應及氧化應激反應。張國明[21]研究表明，緩解MIRI可通過抑制JNK信號通路的活化、降低炎癥反應得以實現，與本研究結論一致。

綜上所述，PRO可抑制JNK信號通路的活化，從而緩解大鼠MIRI。但本實驗涉及到的樣本量較少，在后續的實驗中還需擴大樣本量進行實驗。