基于TLR4/MyD88/NF-κB通路研究愈瘍膠囊抗中耳炎的作用

羅倫才，童 妍，張興國，陳 礴，鐘振東(.涼山彝族自治州第二人民醫院，西昌 65000；.西南交通大學生命科學與工程學院藥學系，成都 600；．四川省醫學科學院,四川省人民醫院實驗動物研究所，成都 60000)

中耳炎(OM)是兒童常見的上呼吸道細菌感染疾病，也是導致傳導性聽力損失的主要原因[1-2]。OM是慢性炎癥，表現為中耳裂處黏液性積液的積累。愈瘍膠囊是涼山彝族自治州第二人民醫院(以下簡稱我院)特色制劑，該制劑對OM、鼻竇炎、術后感染和竇道等外科感染性疾病均具有顯著療效。本研究擬使用愈瘍膠囊對細菌感染性OM進行實驗，探討其體內外抗菌抗炎效果及相關機制，為尋找治療OM的藥物做基礎研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 DSX-30型手提式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；W-CJ-2F型凈化工作臺(蘇州博萊爾凈化設備有限公司)；BA400 Digital型數碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)；Image-Pro Plus 6.0型圖像分析軟件(美國Media Cybernetics公司)；Spectra MAX Plus384型酶標儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.2試藥 愈瘍膠囊(批號190901，規格：0.45 g·粒-1，1 g藥粉相當于原生藥1.5 g)，我院自制；左氧氟沙星(批號DW15201，規格：0.5 g·片-1)，購自第一三共制藥(北京)有限公司；MH培養基(批號028040)，購自廣州環凱微生物科技有限公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的Elisa試劑盒(批號：ZC-36391，ZC-36404，ZC-37624，ZC-37000，ZC-37002)，均購于上海茁彩生物科技有限公司。Toll-樣受體4抗體(TLR4，批號A5258)和β-actin抗體(批號AC026)，購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；髓樣分化蛋白-88抗體(MyD88,批號ab2064)，p-NF-κB抗體(批號ab86299)和生物素化山羊抗兔IgG(批號ab6721)，均購于英國艾博抗(上海)貿易有限公司。

1.3動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量為(230±20)g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。

2 方法

2.1菌懸液的制備 將肺炎鏈球菌置于MH培養基中培養12～18 h，待細菌處于對數生長期后使用無菌生理鹽水制備菌懸液，調整為0.5個麥氏比濁度后將濃度稀釋為106cfu·mL-1，在30 min內完成接種。

2.2受試藥液的制備 取愈瘍膠囊微粉10 g，溶于100 mL無菌生理鹽水中，即為最高濃度，依次往下倍比稀釋8個濃度，備用。

2.3最低抑菌質量濃度(MIC)和最低殺菌質量濃度(MBC)的測定 取2.2項下制備的各濃度受試藥液，加入96孔無菌板中，每孔180 μL，各濃度3個復孔。將稀釋好的菌懸液每孔20 μL加入孔中。另設陽性對照孔(20 μL菌懸液)、陰性對照孔(MH培養基)與空白對照孔(無菌生理鹽水)。將96孔板在37 ℃培養18 h，取出，以肉眼觀察無明顯細菌生長的孔所對應的稀釋度為MIC。取有效抑菌質量濃度的培養液0.1 mL移種至不含藥物的牛肉膏蛋白胨瓊脂平皿上，置于37 ℃培養箱中培養18 h，肉眼觀察細菌生長程度，以培養皿中菌落計數少于5個菌落所對應的藥物質量濃度作為MBC。

2.4分組構建大鼠化膿性OM模型及藥物干預 將50只大鼠隨機分成模型組、陽性對照組(左氧氟沙星20 mg·kg-1)以及愈瘍膠囊高、中和低劑量組(600，300，150 mg·kg-1)，每組10只。造模條件：各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(0.6 g·kg-1)麻醉，用乙醇消毒左側外耳道。用1 mL無菌注射器抽取菌液，向左耳鼓室內注射肺炎鏈球菌懸液(1×108cfu·mL-1)50 μL，即造模完畢，大鼠蘇醒后全部在安靜條件下飼養。除模型組外，各組每日灌胃對應藥物(20 mL·kg-1)，模型組灌胃等劑量無菌生理鹽水，每日1次，持續14 d。

2.5鼓膜觀察 造模后第7天和第14天于手術顯微鏡下觀察大鼠鼓膜色澤、形狀及有無穿孔、積液等情況，評估后進行鼓膜評分。鼓膜炎癥評分標準：鼓膜正常，無炎癥表現，為0分；鼓膜輕度充血，伴輕度內陷，為1分；鼓膜中度充血，伴中度內陷或凸起，并有輕度中耳積液，為2分；鼓膜重度充血和內陷，并有中到重度的中耳積液，為3分；鼓膜穿孔并流膿，為4分。

2.6樣本采集 第7天和第14天將大鼠麻醉后進行眼眶靜脈叢采血，收集血清，在-80 ℃保存，備用；第14 天采血完成后處死大鼠，取左側中耳鼓室，分離部分組織加入40 mL·L-1的多聚甲醛，剩余組織在20 mL·L-1的戊二醛中固定，備用，分別用于病理觀察與電鏡觀察。

2.7大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量測定 將采集好的血清按照試劑盒說明書測定IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.8大鼠血清中免疫球蛋白IgG和IgA的含量測定 將采集好的血清按照試劑盒說明書測定IgG和IgA含量。

2.9大鼠鼓室組織形態學觀察 將固定好的鼓室組織進行包埋切片，使用蘇木精-伊紅(HE)染料進行染色，在光學顯微鏡下觀察切片，觀察鼓室感染情況。

2.10大鼠鼓室組織超微結構觀察 取固定好的鼓室組織，使用掃描電鏡觀察是否出現細菌樣大小及形態的物質、是否出現無定形物質(為細胞外多糖構成)包繞細菌以及上述物質是否黏附在黏膜表面，評價細菌生物膜的形成情況。

2.11大鼠鼓膜中TLR4、MyD88和p-NF-κB蛋白的含量測定 用Western Blot法測定大鼠鼓膜中3種蛋白的含量，并計算目的蛋白的相對表達量。

3 結果

3.1愈瘍膠囊體外抗菌能力 體外抗菌實驗結果顯示，愈瘍膠囊對肺炎鏈球菌的MIC和MBC分別為12.5，25.0 g·L-1。

3.2鼓膜表征觀察 在第7天和第14天對各組大鼠鼓膜進行觀察評分后發現，與模型組相比，陽性對照組和愈瘍膠囊高劑量大鼠鼓膜紅腫、積液情況較輕，評分顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。第14天與第7天相比，模型組及愈瘍膠囊中、低劑量組鼓膜感染情況均有不同程度加重，陽性對照組與愈瘍膠囊高劑量組基本未變。結果見表1。

3.3大鼠血清炎癥因子 與模型組比較，陽性對照組與愈瘍膠囊高、中劑量組的IL-1β、IL-6和TNF-α含量均減少，差異具有統計學意義(P<0.05)；第14天與第7天相比，各組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均有不同程度增加。結果見表2。

表1 鼓膜評分情況

表2 愈瘍膠囊對大鼠血清中炎癥因子的影響

3.4大鼠血清中免疫指標的測定 與模型組比較，第7天愈瘍膠囊高、中劑量組的IgA含量減少，愈瘍膠囊高劑量組的IgG含量減少；第14天愈瘍膠囊高劑量組的IgA與IgG含量均最低，差異具有統計學意義(P<0.05)。第14天與第7天相比，各組指標均有不同程度增加，結果見表3。

表3 愈瘍膠囊對大鼠血清中免疫指標的影響

3.5大鼠鼓室組織病理形態學及超微結構觀察 對大鼠鼓室組織切片進行HE染色發現，與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組OM病變程度減輕，中性粒細胞與壞死細胞數量減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4和圖1。對大鼠鼓室組織切片進行掃描電鏡觀察發現，與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組聽泡黏膜上細菌生物膜形成減少，菌絲分布少，細胞結構完好，結果見圖2。

3.6大鼠鼓室組織相關蛋白的測定 與模型組相比，愈瘍膠囊高、中劑量組的TLR4、MyD88與p-NF-κB蛋白含量均降低，愈瘍膠囊低劑量組中MyD88與p-NF-κB蛋白含量降低，但差異無統計學意義，結果見表5和圖3。

表4 大鼠鼓膜病理學評分情況

圖1 大鼠鼓室病理形態學結果(HE染色，400×)

Fig.1 Staining results of rat tympanic membrane tissue (HE Staining，400×)

A.model group；B.positive control group；C.Yuyang Capsules high dose group；D.Yuyang Capsules middle dose group；E.Yuyang Capsules low dose group；bule arrow：neutrophile；green arrow：necrotic neutrophil；orange arrow：necrotic epithelial cell.

圖2 大鼠鼓室組織電鏡觀察情況(10 000×)

表5 愈瘍膠囊對大鼠鼓膜中蛋白含量的影響

圖3 Western Blot檢測TLR4、MyD88與p-NF-κB的蛋白含量

4 討論

OM作為一種常見的兒童上呼吸道疾病，主要包括急性中耳炎(AOM)、滲出性中耳炎(OME)與慢性中耳炎(CSOM)，其中80%的兒童在3歲前經歷過AOM發作，其中1/3的患者會經歷反復感染，許多發作是由細菌感染引起的[3-4]。OM急性發作會導致咽鼓管功能障礙消失，使滲出液減少轉變成慢性或復發性OM，因此細菌是OM反復發作和轉變成CSOM的關鍵[5]。

肺炎鏈球菌是人類特有的病原體，是引起社區獲得性肺炎、OM、菌血癥和腦膜炎的主要病原菌，主要位于鼻咽，并通過氣溶膠傳播到宿主之間，如果細菌存在于生物膜中，則可能通過黏膜分泌物污染而在宿主之間傳播[6]。肺炎鏈球菌、非分型流感嗜血桿菌(NTHi)和卡他莫拉菌是3種全球已知的主要引起AOM的致病菌[7-8]。國際流行病學對拉丁美洲和加勒比人口的研究也確認，肺炎鏈球菌和NTHi是AOM最常見的細菌病原體[9]。因此，本實驗采用鼓室內注射肺炎鏈球菌構建大鼠OM模型。愈瘍膠囊的體外抗菌能力檢測發現，愈瘍膠囊對肺炎鏈球菌的MIC和MBC分別為12.5，25.0 g·L-1，計算出用于體內實驗的3個劑量分別為600，300，150 mg·kg-1。

鼓膜的狀態是評價OM嚴重程度的重要指標，鼓膜紅腫、內陷和滲液等特征可用于直觀評價模型的構建與藥物的干預效果[10]。使用耳鏡對鼓膜進行觀察評分后發現，模型組鼓膜出現紅腫，部分出現滲液，初步證明模型構建成功。與模型組比較，愈瘍膠囊高劑量組鼓膜腫脹程度減輕，基本未出現穿孔、滲液等情況，可初步說明使用愈瘍膠囊后導致中耳鼓室滲液減少，能減輕鼓膜病變情況，但其干預機制還需進一步實驗說明。

由細菌感染造成的OM會對中耳鼓室造成嚴重損傷，尤其是鼓室黏膜，而通過對組織進行HE染色與掃描電鏡觀察可進一步了解損傷情況與藥物作用效果。在本實驗中，肺炎鏈球菌感染鼓室后，HE染色觀察發現鼓室黏膜內中性粒細胞大量生成，炎性細胞聚集嚴重，使用愈瘍膠囊后情況好轉，黏膜得到不同程度的修復。同時掃描電鏡結果顯示，未經藥物處理的鼓室黏膜上存在大量的細菌生物膜，與肺炎鏈球菌的感染模式相符，使用愈瘍膠囊處理后，黏膜上生物膜減少，逐漸恢復正常狀態。由此說明，愈瘍膠囊能在中耳鼓室產生抑菌抗炎效果。

肺炎鏈球菌是呼吸道感染疾病的主要致病菌，一旦肺炎鏈球菌進入中耳，肺炎溶菌素和細胞壁成分就會引發炎癥，強烈的炎癥是肺炎鏈球菌致病的標志[11]。肺炎鏈球菌釋放的炎癥成分包括肽聚糖、磷壁酸、溶血素、過氧化氫和許多其他分泌的蛋白質[12]，召集來的白細胞吞噬包裹在細胞生物膜中肺炎鏈球菌是無效的，因為細菌未得到有效清除[11]，只會導致促炎介質的釋放增加，如IL-1β、IL-6與TNF-α等[13]。在本實驗中發現，與模型組相比，愈瘍膠囊高劑量組血清中的炎癥因子IL-1β、IL-6與TNF-α含量減少(P<0.05)，14 d后增長緩慢，說明愈瘍膠囊能減少因肺炎鏈球菌引起的炎癥反應。當細菌入侵中耳鼓室黏膜時，會引發機體免疫反應，誘導IgA與IgG生成到達病灶發生作用[14]，巨噬細胞和肥大細胞也會釋放TNF-α[15]。本實驗結果顯示，7 d后模型組血清中IgA與IgG大量生成，由于前期以分泌IgA為主，因此IgA的占比較高，符合感染前期趨勢。使用愈瘍膠囊后，愈瘍膠囊高劑量組血清中的IgA與IgG含量較模型組明顯下降(P<0.05)，14 d后增長緩慢，可說明愈瘍膠囊能降低血清中的炎癥與免疫因子，緩解細菌感染所致的癥狀。

Toll樣受體(TLR)是一類模式識別受體，它識別與微生物病原體相關的分子，在先天免疫系統中起關鍵作用[16]。其中TNF-α可調節TLR通路，調節包括NF-κB[17]，尤其是TLR4的表達[18]。MyD88作為一種受體分子，在細胞表面響應TLR和IL-1β信號時被募集[19]。最新研究表明，TLR4信號通路可通過干預MyD88通路介導細菌感染的OM[20]。因此，尋找抑制TLR4/MyD88/NF-κB途徑的新藥可能是減輕OM的新方向。本實驗使用愈瘍膠囊干預14 d后對中耳鼓室進行蛋白含量檢測，發現愈瘍膠囊高、中劑量組TLR4、MyD88與p-NF-κB的蛋白含量均明顯減少(P<0.05)，表明愈瘍膠囊可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB對炎癥與免疫產生作用，緩解肺炎鏈球菌造成的OM。

5 結論

愈瘍膠囊能延緩肺炎鏈球菌所致的OM進程，主要表現在中耳鼓室黏膜細菌生物膜減少、黏膜結構修復良好、減少炎癥與免疫反應等方面，其潛在治療機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關。