丹參抑制血小板聚集成分的構效關系及協同作用

霍 蘇，崔鶴蓉，田學浩,鄭 娟，姜文艷，戴子琦，高夢怡，項嘉偉，陳可點，吳倩文，王鵬龍，馬 濤*，雷海民*(.北京中醫藥大學中藥學院，北京 0488;.廣元市中心醫院，廣元 68000;.北京工業大學生命科學與生物技術學院，北京 004)

化學成分是藥理作用的基礎，化合物的協同藥理作用是丹參抑制血小板聚集的物質基礎。丹參中主要有兩類生物活性成分，一類是酚酸，包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹參醇、乙酰丹酚酸A、迷迭香酸和原兒茶酸等[1-4]；另一類是丹參酮類，如丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮ⅡB和丹參酮Ⅰ等[4-6]。丹參中多種成分具有抗血小板聚集作用，其作用機制各異[7-9]。除了二萜醌類和酚酸類化合物[10-17]，在丹參中還發現了許多其他結構的化合物，如生物堿、黃芩苷、原兒茶醛、谷氨酸和丙氨酸等非特異性成分，以及鈣、鎂和鋇等無機元素。上述成分中除了酚酸類和丹參酮類成分外，與血小板聚集相關的活性研究相對較少。本研究擬采用構效關系分析、聚類分析、文獻分析和體外試驗等方法，開展丹參中主要活血成分抑制血小板聚集的構效關系及協同作用研究，為相關研究提供依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Olymous ix71倒置熒光顯微鏡(北京昂立博雅科技有限公司)；液體槍(Thermo Fisher Scientific)。

1.2試藥 酚酸和丹參酮，均購自上海阿拉丁生化科技有限公司，質量分數≥98%；大鼠血漿(北京貝迪生物科技有限公司)；血小板稀釋液(南京建成生物工程學院，批號191113-12)。

2 方法

2.1化合物收集 丹參中所有與抗血小板活性相關的化合物的初始構型均收集于PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，并由Hyperchem 8.0和Chemdraw Professional 16.0構建。

2.2文獻分析法 由PubMed數據庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)執行。檢索文章類型為“Article”和“Review”，搜索公式為“丹參與血小板聚集”。采用Pajek和SPSS 22.0軟件進行文獻計量分析。通過消除不能解釋主題的詞匯，制定映射規則，合并同義詞，通過自編程Pajek對高頻詞進行統計，實現高頻詞的統計，統計結果根據生物學意義以表格的形式展示。

2.3結構特征 利用Gaussian 09W計算了B3LYP/6-31G*的幾何構型。并對優化后的穩定構型進行振動分析，根據相應勢能面上的最小點來測試是否存在虛頻率。基于上述B3LYP/6-31G*的優化幾何結構，使用Hyperchem 8.0軟件包[18]中的QSAR模塊進一步計算其物理化學性質。

2.4聚類分析 采用heatmap和K-means聚類方法以及Orange軟件根據數據對象的特征，對樣本或指標進行分類，使得組內相似度最大化，組間相似度最小化，將目標集合分成由類似的個體組成的多個類的無監督分析過程，以抑制血小板聚集活性作為統計量，形成一個對稱的相似性矩陣，以heatmap呈現，將各樣本逐一歸類[19-20]。

2.5體外對血小板聚集的抑制作用 將大鼠血漿分離上清液，制備富血小板血漿(PRP)。取6支干凈試管，在試管中加入PRP 20 μL，再加入血小板稀釋液0.38 mL，用血小板稀釋液稀釋PRP，接著與不同比例的丹參酚酸和丹參酮反應10 min，取1滴反應液，滴于載玻片上，用20×10倒置顯微鏡成像，觀察不同比例丹參酮和丹酚酸類化合物對血小板聚集效果的影響。

3 結果

3.1丹參中抑制血小板聚集酚酸類成分的構效關系 分析文獻檢索，結果顯示，丹參中與抗血小板活性相關的酚酸主要分為2種結構即苯酚和富馬酸，其具有較強的水溶性。主要包括化合物異迷迭香酸α、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹酚酸K、紫草酸、咖啡酸、異阿魏酸、原兒茶酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯和丹參素。其中丹參素是最早在丹參中發現的，且已有研究表明，丹參素具有抗血小板聚集、保護血管屏障、防止脂質沉積及動脈粥樣硬化作用[21-22]。丹參酚酸的結構主要是由丹參與一種或多種咖啡酸、丹參衍生物或迷迭香酸衍生物縮合而成。

基于化學性質計算方法[18]，建立與血小板聚集[16]相關的12種酚酸數據庫，篩選丹參可能作用的基本結構性質。見表1。采用基于熱點圖的聚類分析和決策樹分析對關鍵變量[23]進行篩選。結果表明，與其他性質相比，油水分布系數(lgP)對療效的影響更大，見圖1。lgP是表征藥物脂溶性和極性的重要參數。lgP=(W1÷Voil)÷(W2÷Vwater)(W1：溶解平衡時在油中的濃度；Voil：油相體積；W2：溶解平衡時在水中的濃度；Vwater：水相體積)。也就是說，化合物的親水性越強，活性越強。

表1 丹參中抑制血小板聚集酚酸類成分的結構特征

圖1 丹參中抑制血小板聚集的酚酸類成分構效關系分析

3.2丹參中抑制血小板聚集丹參酮類成分的構效關系分析 丹參中丹參酮類(二萜醌類)的結構骨架可分為丹參酮類(鄰醌類)和羅列酮類(醌類)[14]。主要包括化合物1,2,15,16-四羥基丹參醌、3alpha-羥基丹參酮ⅡA、隱丹參醌、丹參醇 A、丹參醇 B、丹參醇C、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酸甲酯、丹參新酮、紫丹參素A、丹參二醇A、丹參二醇B、丹參二醇C、丹參酮Ⅰ、丹參酮 ⅡA、丹參酮 ⅡB和丹參酮 Ⅵ。由于在這些羅列酮(醌)類化合物中很少發現與血小板聚集相關的報道，本研究分析丹參中以丹參酮(正醌)為代表的丹參酮(二萜醌)的結構性質和機制。

根據上述化學性質計算和數據分析方法，建立丹參酮類抗血小板聚集藥物數據庫[10-13,24-26]，篩選出丹參酮類抗血小板聚集藥物的基本結構性質，見表2。聚類算法使用K-means分析，2個固定的聚類，10次重復運行，最大迭代300次。對于樹模型的評價，隨機抽樣為10次重復訓練/測試，訓練集大小為95%[19]。對丹參酮類化合物的數據分析結果表明，表面積(約)、lgP和水合能共同決定了這些化合物的功效。這可能與二萜醌的聚苯環結構有關，見圖2。

圖2 丹參中抑制血小板聚集的丹參酮類成分構效關系分析

表2 丹參中抑制血小板聚集丹參酮類成分的結構特征

3.3酚酸與丹參酮類化合物的協同作用研究 許多研究報道了丹參的活性化合物具有抗血小板聚集作用，但其對血小板的作用及其機制尚不清楚[27-28]。丹參的化學成分是其藥理作用的物質基礎。如上所述，丹參中主要的生物活性成分水溶性酚酸和脂溶性丹參酮在血小板聚集作用方面存在一定的差異和聯系。因此，推測這2種成分在丹參中均有一定比例的協同作用，共同發揮抗血小板聚集活性。如何確定這些活性化合物的最佳比例，“道地藥材”是對這個問題的自然解釋。文獻分析結果顯示，不同地區丹參的主要成分含量差異較大，丹參的道地產區包括山東、河南和四川[29-30]。與河南、陜西和山東相比，四川丹參樣品能明顯抑制血栓形成，尤其能改善血液流變學[31]，水溶性酚酸和脂溶性丹參酮在四川丹參中的最佳比例約為30∶1。

基于此，本研究采用體外試驗評價并驗證酚酸類和丹參酮類成分的最佳協同比例，結果見圖3和表3。由圖3可知，不同比例的丹參酮和酚酸對血小板聚集的影響不同，實驗證實丹參中酚酸類與丹參酮類的最佳比例為30∶1。

圖3 丹參酮有效提取物(0.5 mg·mL-1)體外對血小板聚集的抑制作用

表3 丹參酮與酚酸(0.5 mg·mL-1)不同配比對血小板聚集的影響

4 討論

心腦血管疾病嚴重威脅人類健康，有研究者對活血化瘀中藥的服用與心腦血管疾病的發生關系進行了探討，大量研究表明，該類中藥通過抗血小板聚集發揮防治心腦血管疾病的作用。中藥丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge.) 的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血通經和清心除煩的功效。現代藥理學研究表明，丹參是臨床上廣泛用于治療心血管病的藥物。丹參的化學成分是其藥理作用的物質基礎。如上所述，丹參中有水溶性酚酸和脂溶性丹參酮這2類主要的生物活性成分[32]，丹參脂溶性成分可以分為丹參酮類(鄰醌型) 和羅列酮類(鄰羥基對醌型)，丹參酮類化合物多屬于二萜類化合物。臨床上常用的含丹參制劑有丹參注射液、復方丹參片和復方丹參滴丸等，丹參注射液中含有的丹參ⅡA磺酸鈉，一方面具有保護心血管的作用，可改善心肌缺血，保護心臟[33]；另一方面具有抗血小板作用，可抑制血小板的活化和聚集；復方丹參片和復方丹參滴丸是由丹參、三七和冰片三味中藥配制而成的中成藥，制劑中的丹參多酚酸鹽是從丹參中提取的水溶性酚類化合物，具有抗炎、抗血小板聚集和抗氧化作用。

在構效關系分析中，基于QSAR計算方法，采用基于heatmap的聚類分析和決策樹分析對關鍵變量進行篩選，建立了丹參中與血小板聚集相關的12種酚酸和17種丹參酮數據庫，篩選出影響丹參抗血小板聚集作用的主要結構性質。結果表明，lgP是決定酚酸有效性的最重要因素，表明化合物的親水性越強，活性越強；表面積(約)、lgP和水合能共同決定了丹參酮類化合物的功效，表明藥物在體內的溶解、吸收、分布、轉運與藥物的水溶性、脂溶性即lgP有關。藥物要有適當的脂溶性，才能擴散并透過生物膜，而水溶性才有利于藥物在體液內轉運，達到作用部位與受體結合，從而產生藥物效應，所以藥物需要有適當的lgP。這是由于分子克服晶格能是吸收能量的過程，而水合過程是釋放能量的過程。減小晶格能，增加水合能，可促進溶解。水合能由藥物與水分子的作用方式決定，與化合物本身的結構、極性和離子化性質相關。分子極性表面積是化合物內極性分子的總表面積，多為氧原子及氮原子，也包括與其相連的氫原子。極性表面積是評價藥物在細胞內的可運輸性質的描述指標。這一參數的大小與藥物在人體內的小腸吸收量、腸道吸收細胞滲透(Caco-2)單層可透性及血腦屏障的穿透性顯著相關。當一分子的極性表面積大于1.4 nm2時，其在細胞的穿透性就會變差。丹參抑制血小板聚集時，lgP、表面積(約)和水合能能否在適當的范圍內，會影響丹酚酸和丹參酮在體內的溶解性、小腸吸收量和細胞膜穿透性，從而影響丹參抗血小板聚集的效果，使丹參的起效濃度升高。

協同作用研究結果顯示，不同地區丹參的主要成分含量差異較大，結合體外試驗結果得到的最佳協同比例發現，丹酚酸和丹參酮協同比例為30∶1時，丹酚酸的酚羥基能使藥物在體內保持合適的溶解度，有利于藥物的轉運，使藥物到達用藥部位；丹參酮的酮羰基使得藥物有合適的脂溶性，能夠擴散并透過生物膜，為丹參抗血小板聚集相關研究提供依據。