中藥中蒽醌類的肝毒性及其分離分析技術研究進展

韓繼麗，胡倩倩，崔 霞，王格格，傅 強(西安交通大學藥學院，西安 710061)

蒽醌類化合物是何首烏(Polygonummultiflorum)、番瀉葉(Foliumsennae)、決明子(CatsiatoraL.)、大黃(RheumpalmatumL.)、蘆薈(Aloevera(Haw.) Berg)等多種常用中藥的主要活性成分，主要用于抗腫瘤、瀉下、抗菌、抗氧化、利尿和止血等[1]。蒽醌類化合物在天然藥物中主要以游離態形式和與糖成苷的結合態形式共同存在，在體內常以與葡萄糖成苷的形式存在[2]。蒽醌類化合物中最重要的生物活性成分為大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃酸(rhein)和大黃素甲醚(physcion)[3]。對含有蒽醌類化合物的體內外樣品的分離分析方法主要有薄層色譜法[4]、分光光度法[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、膠束電動色譜法[7]和毛細管電泳法[8]等。蒽醌類化合物的基本結構見圖1。

圖1 蒽醌類化合物的基本結構

1 蒽醌類化合物的肝毒性研究概況

目前報道的導致肝毒性的含蒽醌類中藥主要集中在何首烏，何首烏產生肝毒性與其含有蒽醌類成分有關[9]。關于何首烏等以蒽醌類化合物為主要活性成分的中藥導致肝毒性的具體機制目前尚未明確，國內外研究人員進行了大量與何首烏誘導的肝損傷相關實驗，為理解其毒性產生機制提供參考，見表1。此外，也有研究報道了其他以蒽醌類化合物為主要成分的中藥產生肝毒性，見表2。

表1 何首烏中主要蒽醌類成分的肝毒性

表2 蒽醌類化合物的肝毒性與致癌性

研究者利用高內涵檢測法檢測蒽醌類化合物對正常人源肝細胞HepaRG的細胞毒性，并對其進行了DNA損傷分析，結果顯示，所研究的大黃酸等4種大黃蒽醌類化合物均可不同程度地對肝細胞產生毒性[10]。含有蒽醌類化合物中藥所致肝毒性的機制可能有以下幾種：①蒽醌類成分具有類似腎上腺皮質激素樣作用，在一定濃度范圍內能抑制肝細胞的生長，導致肝細胞凋亡[11]；②蒽醌類化合物在體內代謝過程中產生某種肝毒性物質，引起肝細胞脂質過氧化導致肝細胞壞死[12]；③蒽醌類化合物或其代謝產物影響膽汁酸轉運體與代謝酶的功能和表達，使肝細胞正常的結構和代謝功能發生異常[13]；④由于人肝臟代謝酶遺傳具有多態性，部分人體內存在先天肝臟代謝酶缺陷，在服用含有蒽醌類化合物及其制劑后，藥物會在代謝和生物轉化過程中蓄積致毒；⑤對蒽醌類化合物過敏的人群一旦服用此類藥物則易發生超敏反應從而損害肝臟；⑥導致蒽醌類成分產生肝細胞毒性的可能分子機制之一為氧化應激損傷，如大黃素甲醚會顯著升高活性氧和導致線粒體損傷，蘆薈大黃素產生肝毒性則主要表現為對肝細胞游離Ca2+水平的調控作用[10]。

2 蒽醌類化合物的檢測方法與問題

2.1HPLC法 HPLC法在蒽醌類化合物的分離分析中發揮著重要作用[31]。由于蒽醌類化合物的母核具有共軛結構，可采用紫外-可見分光光度法(UV)進行檢測。目前常采用高效液相色譜-紫外可見分光光度法(HPLC-UV)對蒽醌類化合物進行定性定量分析[32-33]，結果表明，HPLC-UV法檢測靈敏度與樣品前處理方式相關性很大。對于蒽醌類化合物的提取分離方法主要是pH梯度萃取法[34]與超聲輔助萃取法[35]。近年來，越來越多的研究者開始采用分散液相微萃取法(DLME)[36]、離子液體鹽誘導液-液萃取法(IL-SI-LLE)[37]和固相萃取(SPE)法[38]等樣品前處理方法，建立了可用于蒽醌類化合物體內外樣品提取、純化的新方法。有研究者將微波輔助離子液體均相液液微萃取與高效液相色譜-二極管陣列檢測技術結合，用于藥用植物中蒽醌類化合物的測定[39]。Hu K等[40]建立了以雙(四氧環[2]芳烴[2]三嗪)改性硅膠為固相吸附劑同時測定人尿中5種痕量蒽醌類化合物的超高效液相色譜法，檢測限可達到3.9×10-9～5.7×10-9g·mL-1。殷召軍[41]建立了以離子液包裹的四氧化三鐵作為吸附劑的磁性固相萃取法，并將其用于富集檢測大黃中蒽醌類成分。Wu X Q等[42]將選擇性加速溶劑萃取法與超高效液相色譜法結合，可有效分離蒽醌類化合物并同時快速測定蒽醌類化合物。

Liu Y等[43]將超高效液相色譜法與電噴霧電離軌道阱質譜法聯合，分離鑒定了大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等5種蒽醌類化合物，該方法的檢測限可達到1×10-10g·mL-1。目前關于蒽醌類化合物導致肝毒性的具體毒性成分、特定化學結構、劑量均未闡明，聯用技術必定在今后成為此類化合物分析的重要手段。HPLC法被廣泛用于中藥材及中藥制劑中蒽醌類化合物的含量測定、限量檢查及系統的方法學研究中，能較客觀地反映供試樣品中蒽醌類化合物的狀況[44]。但在實際應用中還存在一些問題，對高效液相色譜提出了新的挑戰。比如：①中成藥樣品、保健品和生物血漿樣品中蒽醌類化合物的含量較低，且樣品成分復雜，干擾較大；②樣品的制備方法及前處理方法會顯著影響蒽醌類化合物的含量測定結果；③同時分析樣品中多個蒽醌類化合物時，分析時間很長；④由于中草藥樣品中存在種類繁多且濃度差異很大的物質，通常很難實現分析物與樣品基質的基線分離；⑤液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)和氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)法靈敏度高、重復性好，但儀器價格昂貴，限制了其廣泛應用。

表3 HPLC法在蒽醌類化合物分離分析中的應用

2.2毛細管電泳法(CE) CE法又被稱為高效毛細管電泳或毛細管電分離法，樣品前處理更為簡便，分析效率更高，因此其在蒽醌類化合物的分離分析中也有較多發展。大部分研究集中于改善毛細管色譜的緩沖液體系，以達到更好的分離效率。WANG De-Xian等[51]以四丁基溴化銨的乙腈溶液作為非水相介質，顯著提高蒽醌類化合物的分離效率。對于蒽醌類化合物的毛細管電泳檢測一般也采用紫外檢測法，也有研究者采用毛細管電泳安培檢測法對蒽醌類化合物同時進行分離與檢測[52]。

對于成分復雜的中藥復方制劑，采用HPLC法測定往往會污染色譜柱，導致柱效降低。而毛細管柱易沖洗再生，但是毛細管電泳存在重復性較差、線性范圍窄、靈敏度低和尚無專屬的監測器。將CE與其他技術如流動注射進樣[53]、質譜[54]和核磁共振技術[55]聯用，以及不同電泳技術之間的聯用, 可快速完成眾多復雜成分的分離與結構鑒定，使CE的應用范圍擴大，從而彌補該技術的一些缺陷。

表4 CE在蒽醌類化合物分離分析中的應用

2.3分光光度法 分光光度法因具有設備簡單、操作方便等優點被廣泛用于蒽醌類化合物樣品的分析。主要采用UV、近紅外光譜法(NIRS)以及熒光分光光度法。

蒽醌化合物可與鎂離子發生配位反應生成在505 nm波長處有最大吸收的配合物，潘小紅等[61]利用此性質測定了保健食品中蒽醌類化合物的總量。吳利敏等[62]利用NIRS法對虎杖中蒽醌類化合物進行定量分析，結果表明，NIRS法準確度較高，且能滿足虎杖中多組分同時測定的精密度要求。部分蒽醌類化合物在有機溶劑中還具有熒光特性, 因此也可采用熒光分光光度法對其進行測定[63]。楊黎燕等[64]基于蒽醌類化合物在丙酮溶液中具有較強熒光的原理，建立了測定中藥中蒽醌類化合物的熒光分光光度法, 結果顯示，蒽醌類化合物的熒光強度與其質量濃度在0.4～50 μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。

分光光度法的測定結果影響因素較多，一般只能測得一類物質的總含量。對于紫外分光光度法，僅含有α-酚羥基或鄰位二酚羥基的蒽醌類化合物才可與鎂離子絡合從而使吸收峰位發生紅移，不具有這2種結構的蒽醌類化合物無法被檢測到，因此相應的測定值偏小。熒光分析只適用于本身具有熒光或者可以衍生/淬滅熒光的化合物，在應用范圍上有一定的限制。

2.4核磁共振波譜法(NMR) NMR法被分析的質子引起共振的綜合強度與產生共振的質子數和分析物的濃度成正比。與傳統的色譜定量方法相比，核磁共振氫譜(1HNMR)更適合于同時鑒定和定量復雜基質中的生物成分。

1HNMR在中藥中生物活性成分的含量測定方面應用越來越多。王志偉等[65]建立了測定何首烏及其炮制品中大黃素和大黃素甲醚含量的氫核磁定量方法，該方法測試溶劑為氘代二甲基亞砜，內標物為順丁烯二酸，定量目標信號為大黃素的H-7、大黃素甲醚的H-7，測定結果與HPLC-UV法測定結果基本一致。一種快速測定大黃中5種活性游離蒽醌的1HNMR法利用大黃特征信號可準確定量大黃中5種蒽醌類化合物[66]。

2.5流動注射化學發光分析法 化學發光分析法作為一種微量和痕量技術通常難以保證樣品與發光試劑快速、高度重現地混合。而流動注射作為一種可實現自動化進樣和分離富集的技術，可與多種化學分析手段聯用。流動注射-蒽醌抑制化學發光法基于蒽醌類化合物在堿性溶液中對次氯酸鈉-魯米諾等化學發光體系有顯著抑制作用,且抑制程度與蒽醌類化合物濃度呈線性關系，從而實現對蒽醌類化合物的快速準確檢測。屈穎娟等[67]提出了可直接測定蒽醌類化合物的流動注射化學發光分析新方法，檢出限為2×10-9g·mL-1。目前，限制該方法廣泛應用的主要原因是其選擇性較差。

2.6其他方法 蒽醌類化合物的測定方法多樣，除以上方法外，高速逆流色譜法無需固體分離介質，故克服了因使用常規固相載體而引起樣品吸附損耗的不足，且制備量大，分離效率高，溶劑用量少，因此在蒽醌類化合物分離分析中應用逐漸增多[68-70]；極譜法(Polarography)具有操作簡便、快速、靈敏和選擇性好的優點，在測定一些蒽醌類化合物的含量方面具有一定優越性[71]；超臨界流體色譜法在此類化合物的分析中具有很好的應用前景[72]。電化學分析方法靈敏度高、選擇性好、響應時間短和操作簡便，有研究者制備石墨烯/聚多巴胺/金(GNs/PDA/Au)復合納米材料并將其應用于構建電化學傳感器從而對大黃素進行檢測，建立的方法檢測限為5.0 μmol·L-1[73]。

3 小結與展望

目前，關于蒽醌類化合物產生肝臟不良反應的文獻多集中于幾種特定的蒽醌類化合物，而對其他蒽醌類化合物研究較少。目前對含有蒽醌類化合物的中藥發揮諸多藥理作用的研究仍以其中所含多類化學成分協同作用為主，對此類藥物的特定藥用成分研究將成為今后研究的重點。目前仍然需要開發更為簡單、可靠和廉價的方法來分析藥用植物及其制劑中的蒽醌類化合物，采用對環境無害的方法和低成本的原料，開發高效率、高收率和高選擇性的技術以分離工業和藥理學上重要的蒽醌類化合物。此外，隨著新型分離分析技術的進步，進一步完善蒽醌類化合物的測定方法，使測定的指標成分與藥理活性密切關聯。