微生物菌劑對土壤酸堿性的改良研究

彭喜之，王濤輝 ， 馬珺 怡，童應凱，王雪梅，張 敏，葉玉棟，陳帥君*

(1. 天津農學院農學與資源環境學院生物技術系 天津300384；2. 天津恒基利得生物科技發展有限公司 天津300392)

0 引 言

土壤是農業發展基本的生產資料，土壤質量優略直接影響農業的健康發展。鹽堿化是影響土壤質量的一個關鍵問題。鹽堿地是鹽類集積的一個種類，是指土壤里面所含大量的鹽分會破壞土壤水分的平衡，改變土壤的結構，致使土壤通透性變弱，滲透率變大，容易板結和膠粘，土壤肥力下降，影響到作物的正常生長。我國有 9913萬公頃鹽堿化土地[1]，堿土和堿化土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累積有關，因而堿化度普遍較高，嚴重的鹽堿土壤地區植物幾乎不能生存[2]。

本研究通過微生物發酵菌肥修復技術來對鹽堿土和酸性土進行改良[3]。鹽堿土中富含大量鹽堿成分，而酸性土壤中存在著過酸物質，故制備微生物菌肥所用的微生物菌株必需具有耐酸、耐鹽、降鹽特性，才能在鹽堿化和酸化土壤中起到治理作用[4]。研究選育耐鹽、降鹽微生物在本課題中具有關鍵作用，如果能從過酸、過堿物質或土壤中提取出某些具有抗酸堿性并能在其環境下生長的菌種[5]，將其投入肥料生產，施肥于鹽堿土地，可以達到改良土地酸堿性的目的。本文從動物糞便與鹽堿土壤中提取出部分菌種，用于進行鹽梯度生長測試；篩選出 4個耐鹽菌株，通過分別測試其對鹽堿土和酸性土的中和降解能力，研究4種菌與肥料混合發酵后對土壤酸堿性調節的最佳比例并獲得了成功。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與菌種

從天津靜海雞養殖場(恒基利得生物科技發展有限公司)獲取的雞糞便、鹽堿土壤。

1.1.2 培養基

富集培養基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂 15～20g，水 1000mL，pH 7.0～7.2。

M6 培養基：MgS04·7H20 0.25g，葡萄糖 10g，NaCl 20g，FeSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO413.6g，去離子水 1000mL，pH 7.5(KOH 調節)。用于菌株篩選培養。

M63 鹽梯度培養基：FeSO4·7H20 0.5g；KH2PO413.6g；(NH4)2SO42.0g；MgSO4·7H2O 0.25g；葡萄糖10g；NaCl視需要，自來水1000mL，pH 7.5(KOH調節)。用于菌株篩選培養。

1.2 主要儀器

pH儀(STARTER 2100S上海奧豪斯儀器公司)，無菌操作臺(BCM-1300A 蘇凈安泰)，恒溫培養箱(PH240A 上海一恒科技有限公司)，電子天平(AR124CN 上海奧豪斯儀器公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-30FBS 上海申安醫療器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物菌株分離

根據吳曉衛[4]的方法，從雞糞和鹽堿土壤中分離菌種。

1.3.2 耐鹽菌篩選

選取培養皿上生長快、直徑大的菌株用平板劃線法接在平板上，在 30 ℃的恒溫培養箱培養 72h。所得菌落再次劃線轉接到平板上并在恒溫培養箱中培養，之后將平板上的單菌落轉接斜面，置于冰箱 4 ℃保存。其中每項操作均重復3次。

篩選出 4 種生長良好的菌：N1、N2、N3、N4。篩選結果生長情況見表1。

1.3.3 菌株形態鑒定

將所得菌株劃線轉接到富集培養基平皿內，30℃恒溫培育 24h后，顯微鏡觀看菌株生長情況和形態特征：記錄菌體形態、菌體大小、菌落質地、菌落邊緣。鑒定參照微生物學《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏系統細菌學手冊》實行。

表1 菌落篩選結果Tab.1 Results of colony screening

1.3.4 所選菌株性能檢測

將經過鑒定的微生物菌株分別接入液體鹽梯度培養基，培養基含 NaCl量分別為 10、20、30、40、50、60g/L。30℃恒溫搖瓶發酵 24h，運用紫外分光光度計法吸光度 595nm值[9]檢測發酵液內菌體數來判定菌株對鹽耐受生長情況[9]。

1.4 微生物菌肥發酵工藝

1.4.1 發酵原料和工藝流程

以雞糞為原料，糞便含水量很高，pH自然。

圖1 工藝流程Fig.1 Process flo w

斜面保藏的菌種轉接到相應的培養基培養進行活化，30 ℃恒溫 24h。巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌用肉湯培養基培養[10]；酵母用 PDA培養基培養[11]。活化后的菌株留待擴大培養。

1.4.2 混合菌劑拮抗性能研究

將所得到的固體菌劑按照不同比例混合制備混合菌劑[12]，并轉接到同一肉胨平板上和同一肉胨培養基搖瓶內培養，探究混合菌劑間是否產生拮抗抑制作用[13]。通過觀察平板上菌落生長情況、菌落數目、表面形態和檢測搖瓶內各菌含量判斷是否具有拮抗作用。

1.4.3 復配方案

按照吳曉衛[4]的方法，按照 1%接種量將混合菌劑接入糞便混合物中進行發酵，研究不同比例制成的混合菌劑對發酵結果的影響[14]。以發酵菌肥中大分子有機質降解多(有機質含量高)、活菌數目多和發酵過程升溫快、保溫時間長(有利于殺死糞便中的蟲卵、病毒或減少有害物質和促進菌肥腐熟)的混合比例作為菌種最佳復配比例，最佳比例見表2。

1.5 土壤pH值恢復測定

1.5.1 單菌種對土壤pH值恢復測定

取天津農學院內農學種植土壤用 NaOH和 HCl調節 pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個分組做 3 次，取平均值[14]。將各試驗菌種分別施入并測定其對pH的恢復能力，設立一組對照組，加入等量超純水進行對照[15]。

表2 混合比例Tab.2 Mixing ratio

1.5.2 復配菌種對培養基pH恢復能力測定

按復配方案中的比例將其與肥料混合發酵，再次取天津農學院內農學種植土壤用NaOH和HCl調節pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個分組做 3 次，取平均值[16]。施入并測定4種方案對pH值的恢復能力。

2 結果與分析

2.1 菌株形態鑒定

根據微生物學《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏系統細菌學手冊》判斷出圖 2至圖 5的結果。N1為巨大芽孢桿菌屬，N2為枯草芽孢桿菌屬，N3為假單胞菌屬，N4為酵母菌屬。

圖2 N1巨大芽孢桿菌屬Fig.2 N1 Bacillus megaterium

圖3 N2枯草芽孢桿菌屬Fig.3 N2 Bacillus subtilis

圖4 N3假單胞菌屬Fig.4 N3 Pseudomonas

圖5 N4酵母菌屬Fig.5 N4 Saccharomyces

2.2 菌株性能檢測

如圖6所示，其中枯草芽孢桿菌屬在鹽濃度超過50g/L時可繼續生長，較其他菌屬耐鹽含量高，其最適生長濃度為 45g/L左右；其次是巨大芽孢桿菌屬，鹽濃度達到 50g/L的培養液內菌體數超過另外兩種，菌體數在鹽含量 30g/L時達到最高[9]，巨大芽孢桿菌總體生長情況不如枯草芽孢桿菌；假單胞菌屬和酵母菌屬的最適鹽濃度為 20g/L，過高的鹽濃度對它們的生長有毒害作用。

圖6 NaCl含量對各菌株生長影響Fig.6 Effect of NaCl content on growth of each strain

2.3 混合菌劑拮抗性能

實驗發現混合菌劑在肉胨培養基上和搖瓶內(吸光度595nm檢測)4種微生物均生長良好，無拮抗性作用，可以混合使用。

2.4 單菌種對土壤pH恢復測定結果

單菌試驗結果如圖7至圖10所示。

圖7 巨大牙孢桿菌對土壤pH恢復測定Fig.7 Determination of soil pH recovery by Bacillus megaterium

圖8 枯草牙孢桿菌對土壤pH恢復測定Fig.8 Determination of soil pH recovery by Bacillus subtilis

圖9 酵母菌屬對土壤pH恢復測定Fig.9 Determination of soil pH recovery by Saccharomyces

圖10 假單胞菌屬對土壤pH回復測定Fig.10 Determination of soil pH recovery by Pseudomonas

表3 對照組pH變化測定Tab.3 Change of pH value in control group

以上各圖中 2至 8為起始設定土壤 pH分別為2、4、6、8、10、12、14 組的待測樣品。從數據結果可知：枯草芽孢桿菌對 pH的恢復是顯著的，在 pH呈酸性時恢復能力穩定，能逐漸將其恢復到 pH 6以上并接近7的程度；而在pH呈堿性時恢復能力則較弱一些，隨著 pH的逐漸升高恢復能力減弱。巨大芽孢桿菌與其相似，但在 pH呈堿性時恢復能力上顯得更弱一些。而酵母菌與假單胞菌在pH為酸性時的恢復能力穩定，但 pH呈堿性時恢復能力變弱，隨著 pH的升高而降低。通過觀察對照組可知，在 pH土壤過酸的情況下，由于酸性物質的自然揮發會使其 pH向平衡的一端轉移，但是若沒有微生物菌劑輔助的話，往往在某一個階段就停止變化。根據表 3對照組所示，堿性土壤或過堿土壤中的 pH則幾乎不隨時間變化而變化，很好地展示出了微生物對土壤的修復能力。其中枯草芽孢桿菌對土壤恢復能力最佳，其次為巨大芽孢桿菌，假單胞菌與酵母菌屬最弱。

2.5 復配菌種對培養基pH恢復能力測定結果

由圖 11可知，A方案的恢復能力在 pH呈酸性時恢復能力不錯，但在 pH呈堿性時弱于其他組。B方案與D方案對比A方案較強。但是C方案在pH呈酸性或堿性時，其恢復度都與其他 3組有明顯差異，在 pH呈酸性時穩定上升，在 pH呈堿性時則與其他組不同，產生了顯著效果，使 pH下降迅速且穩定。4種復配比例下的混合發酵中，對土壤 pH恢復能力為C＞B＞D＞A；最佳配比為枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶假單胞菌∶酵母菌＝1∶2∶1∶1。

圖11 4個比例的復合菌劑pH恢復測定Fig.11 Determination ofpH recovery by four proportions of compound bacteria

3 討 論

本研究從天津靜海雞養殖場的糞便和鹽堿地中分離出4種對酸堿有抗性并能改良其pH值的菌屬，對其進行鏡檢觀察并對照《手冊》大致確定其為：枯草芽孢桿菌屬、巨大芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母菌屬。在確定之后分別測定了 4種菌對酸堿土壤的恢復能力，并安排了對照組進行對比，最后確定枯草芽孢桿菌屬對土壤pH恢復的能力最佳。對混合菌劑開展了拮抗性試驗，發現菌劑在同一平板和同一搖瓶實驗中未顯示菌株間有拮抗性，菌株生長良好。

確定混合菌劑肥最佳復配比例，再以 1%接種量雞糞為原料來發酵微生物菌種，測定土壤 pH恢復值作為評價標準，最終確定了4種混合菌劑的最佳配比為 1∶2∶1∶1，在此比例下對土壤 pH 值恢復能力最佳。

由于實驗材料的限制，本研究用以發酵微生物菌肥的菌株篩選方法比較單一，需要多次重復的實驗過程才能得到高效株，過程繁瑣。可以考慮結合化學誘變劑、等離子體誘變技術和基因組技術對菌株進行改造，獲得耐鹽性強的突變菌株。后續將嘗試運用誘變等方法盡可能篩選出更高效的菌株并再次測定，之后施入土壤并種植作物以測定更多數據。