基于網絡藥理學與分子對接的新冠肺炎三焦疫毒寒濕癥用藥機理研究

杜海濤，王平，李娜，丁潔，張敬，袁成民，孫鐵鋒，韓莉，張忠法

(1.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014；3.天津大學 精密測試技術及儀器國家重點實驗室，天津 3000722；4.濰坊市中醫院，山東 濰坊 261000；5.濟南市傳染病醫院，山東 濟南 250021)

新冠肺炎(COVID-19)是一種由新型高致病性的冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染引起的蔓延到全世界范圍的急性呼吸道傳染病[1-2]。該病潛伏期長、傳染性強，人群普遍易感，臨床上以發熱、干咳、乏力為初期表現，后期嚴重患者還會出現胃腸道嚴重不適、急性呼吸窘迫綜合征等癥狀，在全世界范圍內廣泛傳播，對人們的生產生活和健康造成了巨大威脅[3]。

山東省COVID-19病例以輸入性為主。該地地形復雜，沿海地區傍水、內陸地區地平易濕，發病季為冬春之交，氣溫仍低，極易感外寒。而COVID-19具有典型的濕毒致病特點，疫毒從口鼻入，侵襲氣道，進一步出現邪犯肺衛、邪犯腸胃等證[4]。患者攜帶原發濕疫并由于山東復雜地域與時令，易從上向下至三焦傳變，多數病人辨證為“三焦疫毒寒濕癥”，《疫證治例》云“疫病邪自中作，或出而三陽三陰之經，入而三陽之腑，三陰之臟，每隨人元氣之厚薄、臟腑之寒熱以為傳化”。三焦疫毒寒濕癥藥隊出自濟南市COVID-19救治定點醫療機構——濟南市傳染病醫院總結的P2藥隊，針對COVID-19寒、濕、毒、瘀特點兼扶正達邪、三焦分治之《傷寒論》桂枝湯、《溫病條辨》三仁湯或藿樸夏苓湯化裁而來。藥隊由桂枝、廣藿香、防風、貫眾、半夏、澤瀉、茯苓構成：桂枝溫陽化氣以利水，可解表宣肺；廣藿香芳香化濕之效溫煦而不燥烈，能除中焦濕邪，并助脾胃正氣；防風乃風藥，可解表發汗、祛風勝濕，瀉上焦補下焦，能治肺實，散肝舒脾；貫眾清熱解毒；清半夏燥濕化痰，降逆止嘔；澤瀉、茯苓淡滲利濕，可解困脾之濕，諸藥合用，可治療三焦疫毒寒濕。在此基礎上，根據患者自身情況靈活加減味進而演化成多個對癥COVID-19患者臨床用方，對收治入院的35例患者進行治療，已取得良好的治療效果[5]。本研究從分子調控出發，運用分子對接及網絡藥理學方法，尋找三焦疫毒寒濕癥藥隊治療COVID-19的直接及間接作用機制，確定在機體網絡中重要靶標，為三焦疫毒寒濕癥系列方在抗疫戰中發揮更大的作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥隊中入血成分的篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese system pharmacology database and analysis platform, TCMSP, https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索桂枝、廣藿香、防風、貫眾、半夏、澤瀉和茯苓的活性成分。根據TCMSP靶點篩選指南和化合物ADME(absorption, distribution, metabolism, excretion)參數，設置口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18，以此條件篩選，并下載*.mol2結構文件建立藥隊中核心成分的數據庫[6]。

1.2 活性成分靶標預測

將收集的化學成分逐一輸入至Open Babel，將化合物結構轉化為SMILES并導入到Swiss Target Prediction數據庫(http://swisstargetprediction.ch/)，設置種屬為“homosapiens”，將篩選后的化合物與數據庫中靶點進行模擬對接，基于二維/三維結構相似性預測化合物靶點，選取結果Probability大于0的靶點建立化合物靶點數據庫，并導入Cytoscape 3.7.1進行可視化，生成藥隊成分-靶標網絡[7]。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

將1.2下預測到的靶標導入 STRING平臺(https://string-db.org/)進行蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，設定物種為人，將最低相互作用閾值設置為 0.99 進行篩選，隱藏離散節點，構建PPI網絡關系。下載結果以*.tsv 格式保存，導入Cytoscape3.7.1可視化，并用Network analyzer 插件分析網絡特征靶點。以“度值”評價節點的重要程度，度值代表網絡中與該節點直接作用的節點數目，值越大表示參與的生物功能越多，其生物學重要性越強，并以度值數值大小為PPI節點著色。

1.4 基因本體論及信號通路分析

將靶點基因名用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)轉換為Uniprot ID。在DAVID(the database for annotation,visualization and intergrated discovery)6.8平臺(https://david.ncifcrf.gov)對核心靶點進行基因本體分析(gene ontology,GO)及京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析，選擇差異性有顯著統計學意義(P≤0.01)的條目，得到關鍵核心靶標參與的過程及通路信息。

1.5 分子對接

在 PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)檢索 Mpro 與 ACE2 的人源高分辨晶體結構(PDB ID: Mpro-6LU7; ACE2-1R42)，導入薛定諤Maestro 11.9軟件。使用Protein Preparation Wizard套件預處理原始結構，包括向蛋白質中添加氫原子、鍵順序的分配以及刪除5?以上的水分子；使用配體結合位點來定義蛋白質的活性位點，使用Receptor Grid Generation套件，使用基于網格的能量學的配體對接算法(glide)生成格點文件；使用LigPrep套件對配體進行預處理，包括互生成不同構象和使用Epik在pH(7.0±2.0)下的電離態，添加氫原子，中和帶電基團，優化配體的幾何構型；最后利用Ligand Docking套件進行分子對接，分析格點結合能值分數，該數值為負則提示能自由結合。本次研究設定對接得分小于-5為結合具有顯著性[8]，以此初步驗證常用藥隊在COVID-19防治的直接作用機理。

2 結果

2.1 藥隊入血成分及靶點篩選結果

從 TCMSP中檢索篩選獲得建立數據庫共含中藥活性成分共 77個，表1為其中的主要活性成分，全部活性成分請查閱OSID。通過Swiss Target Prediction獲取預測靶點 4760 個。利用 Cytoscape3.7.1 構建藥隊成分-靶標網絡見圖1，該網絡共898個節點，4841條邊。圖中，邊代表相互作用關系，綠色方形節點代表成分靶點，藍色橢圓形節點代表活性成分，紅色V型節點代表來源藥物。因部分成分沒有對應靶點，網絡圖中成分節點共68個，其中MOL000358為半夏、防風與桂枝的共有成分，MOL000359為防風、桂枝與澤瀉的共有成分。

表1 常用藥隊活性成分信息

圖1 常用藥隊成分-靶標

2.2 PPI網絡結果

將STRING11.0平臺獲取的 PPI關系導入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化分析，生成PPI網絡如圖2所示。該網絡共有218個節點、254條邊，其中，邊代表PPI關系，方形節點代表靶標蛋白，節點顏色代表度值高低。可見CDK1、AKT1、STAT3、CDK2與PLK1等靶標在網絡中發揮核心作用，具有進一步研究的價值。

注：顏色范圍，表示從左往右為度值降低。

2.3 GO和KEGG 富集結果

將潛在靶點導入DAVID 6.8中進行分析，包含3個分支，即分子功能(MF)、細胞組分(CC)以及生物過程(BP)，篩選P≤0.01的過程，列出富集數前十位的過程(圖3)。其中，在MF層面，預測靶點主要與蛋白結合(protein binding)、ATP結合(ATP binding)和蛋白激酶活性(protein kinase activity)相關；在CC層面，胞漿(cytosol)、胞核(nucleus)和胞質(cytoplasm)所占比例較大；在BP層面，與蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)、RNA聚合酶II啟動子對轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)和信號轉導(signal transduction)關系緊密。

圖3 GO富集分析結果

通過KEGG富集分析藥隊核心成分抗COVID-19可能參與的通路，結果得到P≤0.01的信號通路共105條，圖4列舉了富集數前20位的相關通路。其中 PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、FOXO信號通路(FOXO signaling pathway)、RAS信號通路(RAS signaling pathway)和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等與肺系疾病密切相關。KEGG富集分析表明藥隊的核心成分可能作用于這些通路，從而起到抵御新型冠狀病毒引起的各種癥狀的作用。

圖4 KEGG富集分析結果

2.4 分子對接結果

Mpro 的晶體結構為 6LU7(2.16 ?)，ACE2 的晶體結構為 1R42(2.2 ?)。使用glide gscore來描述配體與受體蛋白的匹配程度，分數絕對值越大，匹配程度越高[9-10]。二者結合分數均小于-5的化合物得分如表2所示。其中，與IR42結合最佳的化合物是(2R)-5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮(MOL001040，glide gscore：-8.708，glide energy：-43.340)，與6LU7結合最佳的化合物是(+)-表兒茶素(MOL000073，glide gscore：-6.881，glide energy：-38.862)，對接模式見圖5。

表2 藥隊核心化合物分子對接分數

圖5 分子對接模式

3 討論

SARS-CoV-2的感染會引起嚴重的肺部炎癥及并發癥，而宿主對病毒感染的免疫反應有限，需要依靠強有力的外部干預。據國家中醫藥管理局通報，多地中醫藥治療COVID-19的參與率可達90%以上，對癥狀有明顯的改善作用[11]。水土有別，人文迥異，中醫藥的有效性關鍵是把握“辨證施治”原則，不應只局限于直接抗病毒藥物，診療方案必須依據發病人群的不同進行相應的調整，從調節機體狀態、改善體內環境、扶持自身正氣、增強抵御外邪能力方面出發，亦可達到治療目的[12-13]。本文所提之藥隊由桂枝、廣藿香、防風、貫眾、半夏、澤瀉、茯苓組成，貫眾味苦，性微寒，《普濟方》云“解一切諸熱度”，凡溫熱毒邪所致之證，皆可用之；桂枝解肌散邪，溫通利水；防風發表勝濕；廣藿香芳香化濕，開胃健脾；半夏燥濕化痰；茯苓、澤瀉，淡滲利濕，諸藥合用，可治療三焦疫毒寒濕。

基于SARS-CoV-2與SARS-CoV基因與結構的對比研究，發現二者基因序列同源性接近80%，進而發現SARS-CoV-2與ACE2受體的親和力明顯高于SARS-CoV，因此SARS-CoV-2傳染性更強[14]。ACE2受體在肺泡上皮細胞在內的多種人體細胞表面表達，是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAS)的關鍵分子[15]。在獲得SARS-CoV-2水解酶(Mpro)和ACE2高分辨率晶體結構基礎上，結合虛擬篩選和酶學測試相結合的研發思路，是歸納篩選新藥的思路之一[16]。從分子對接角度來看，潛在有效化合物(+)-表兒茶素(MOL000073)、兒茶素(MOL000492)、3，23-二羥基-12-齊墩果烯-28-酸(MOL005923)、5-羥基-7，4′-二甲氧基黃烷酮(MOL005911)、(2R)-5，7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并二氫吡喃-4-酮(MOL001040)、黃芩素(MOL002714)、黃芩苷(MOL002776)同屬于黃酮類，占化合物數目的半數以上(54%)，此類化合物與Mpro、ACE2均有較好的親和性，具有進一步開發價值。據報道，黃酮類化合物(尤其是黃酮醇類)具有廣泛的抗病毒抗菌作用[17]。Jo等[18]通過分子對接及蛋白水解法、色氨酸熒光法驗證，發現黃酮類化合物(尤其是黃酮醇類)具有疏水性芳環和親水性羥基，能與SARS-CoV Mpro活性位點完美親和，并有效阻斷Mpro的活性使其失去原本調控復制的能力。綜上所述，藥隊中的黃酮類成分，具有靶向性的抗病毒、抗炎和抗氧化功效，其對接得分小于-5，能夠與靶蛋白自發結合，為開發P2藥隊提供了重要的參考。

本研究基于系統生物學理論，通過網絡藥理學手段檢索到三焦疫毒寒濕癥藥隊77種活性成分，4760個潛在作用靶標，構建了其成分-靶點網絡。通過PPI分析發現靶標CDK1、AKT1、STAT3、CDK2與PLK1在調控中起核心作用，STAT3、EGFR、JUN、MAPK3、PIK3R1、TNF、BCL2、IL1B等主要與細胞因子相關，是調控病毒引發機體過度免疫導致炎性因子風暴的關鍵靶標[19-20]。炎癥反應對于病毒性肺炎是一把“雙刃劍”，有益的炎癥對局部組織抵抗感染具有幫助，但若COVID-19患者的炎癥加劇導致免疫過度反而會危及機體，造成彌漫性肺泡損傷和纖維化、呼吸衰竭和多器官功能障礙，控制炎癥反應對于控制三焦濕寒癥狀向危重癥轉變有重要意義。STAT3可被干擾素(IFN)、表皮生長因子(EGF)、白介素(IL)絲裂素激活的蛋白激酶(MAPK)等激活，介導細胞多種基因的表達，在生長、凋亡、免疫中起關鍵作用。有研究表明，STAT3直接抑制劑能限制細胞因子風暴和T細胞淋巴細胞減少[21]。一項針對COVID-19患者的轉錄組學研究顯示病毒可導致淋巴細胞凋亡，其相關基因設計自噬相關基因BCL2、AKT1、MAPK、PIK3，凋亡相關基因JUN、BCL2、TNF、MAPK，p53信號相關BCL2、CDK2等[22]。提示藥隊多個核心成分參與調控COVID-19患者炎癥、免疫、凋亡、自噬等過程，多途徑多靶點整體調節濕寒癥狀。

本研究運用網絡藥理學和分子對接方法考察了三焦疫毒寒濕癥P2藥隊治療COVID-19的作用機制，主要從抗炎、抗病毒、調節免疫、調節細胞周期、抗癌等方面通過多途徑多靶點發揮作用。值得注意的是，受制于當前對病毒和染病機制認識的不足、計算機預測方法及數據庫數據可靠性等自身局限性的影響，分子對接和網絡藥理學預測可能會存在與實際出現偏差的情況，需要進一步深入研究。