摻釹釔鋁石榴石激光對人滋養層細胞表面抗原2的調控及口腔鱗癌細胞HN6增殖、侵襲和轉移的影響

馬浩然 龔愛秀 湯根兄，2

1南京醫科大學附屬兒童醫院（南京210008）；2國家衛健委抗體技術重點實驗室（南京211166）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是分化程度不同、早期可能出現淋巴結轉移、手術后容易局部復發的一種惡性腫瘤［1］。OSCC 目前仍采取手術為主的綜合治療，患者口腔手術破壞面部和口腔的解剖結構，患者術后生存質量偏低［2］。因此找到合適的非創傷性輔助治療方案，盡量減少手術破壞的口腔頜面部組織，提高患者的生存質量尤為重要。

摻釹釔鋁石榴石激光（neodymium yttrium-aluminium-garnetm，Nd：YAG）因其具有水吸收率高、殺菌、凝血、對周圍組織熱損傷小等獨特優勢顯示出較高的醫學價值和前景［3-4］。應用于常見的窩洞預備、口腔小手術、牙周炎、種植體周圍炎、頜面部血管瘤的治療等［5-6］。在腫瘤方面有皮膚基底細胞癌的治療［7］，但在口腔腫瘤方面Nd：YAG 激光的應用暫未見研究。人滋養層細胞表面抗原2（human trophoblast cell-surface antigens 2，TROP2）是一種無內含子的基因，編碼323個氨基酸，構成約36 kDa 的細胞表面糖蛋白。其在口腔鱗癌中高表達，且能促進口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲與轉移，反之亦然［8-9］。但是Nd：YAG 激光能否調控TROP2影響口腔鱗癌細胞的生物學行為尚不清楚。

本實驗擬通過體外實驗研究Nd：YAG 激光調控TROP2 干預口腔鱗癌細胞的生物學行為，探討抑制口腔鱗癌細胞HN6 增殖、轉移和侵襲的合適激光劑量及可能的作用機制，為激光在口腔鱗癌的輔助治療方面提供理論依據，以期為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料舌鱗癌細胞株HN6（美國ATCC細胞庫）；Nd：YAG 口腔激光治療儀（KJZ 脈沖）（合肥泓博醫學科技有限公司）；CCK-8 試劑（日本同仁公司）；Transwell 小室（美國Corning 公司）；DH5α化學感受態細胞（中國諾唯贊公司）；Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國Thermo 公司）；兔抗人TROP2單克隆抗體、HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（英國Abcam 公司）。

1.2 實驗方法本實驗采用160 mJ、5 Hz的激光能量并用同心圓式的照射方法進行照射，使用激光波長為1 064 nm 的KJZ 脈沖Nd：YAG 口腔激光治療儀，光斑直徑2 mm，頻率1 ～10 Hz 可調，100 ～250 mJ 能量范圍脈沖。實驗前測定激光頭距離板底部的垂直距離為20 mm。Nd：YAG 激光垂直照射24 孔板，使用激光能量測定儀測定其透過24 孔板的能量，其激光能量穩定為740 mJ/s。

Nd：YAG 照射時間設5 組，分別為0、120、240、360、480 s，對應的激光照射能量密度分別為0 J/cm2（未照射）、44.4 J/cm2（低劑量）、88.8 J/cm2（中劑量1）、133.2 J/cm2（中劑量2）和177.6 J/cm2（高劑量）。

1.3 實驗過程

1.3.1 CCK-8增殖實驗96孔板中接種細胞懸液，每組設3 個復孔，四周加入PBS 溶液防止水分蒸發，將培養板置于培養箱中培養24、48 h（37 ℃，5%CO2）。棄去原有培養基，向培養板每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，在培養箱中繼續培養2 ～3 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度，實驗重復3 次。

1.3.2 細胞劃痕試驗HN6 細胞按不同劑量照射后進行劃痕，用200 μL 無菌槍頭比對直尺，垂直于孔板底細胞劃痕，槍頭劃痕要求直，洗去劃下的漂浮細胞，將其加入無血清DMEM 培養基后置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養，倒置顯微鏡下觀察細胞在培養0、12、24、48 h 后劃痕寬度的變化，分組拍照記錄，利用Image J 軟件來測量劃痕區的像素定量比較各組細胞劃痕愈合的能力。同等條件下，實驗獨立重復3 次。

1.3.3 Transwell侵襲實驗預冷的槍頭吸入100 μL Matrigel 膠加到500 μL 無血清培養基，稀釋至終濃度為1 mg/mL。在Transwell 小室底部中央垂直加入100 μL 稀釋后的Matrigel 膠。無血清的DMEM培養基將五組激光照射后HN6 細胞制成細胞懸液，Transwell 的上室中加入細胞懸液200 μL，下室中加入含10%FBS 的500 μL 培養基。將其放于37 ℃、5% CO2環境中孵育48 h。去除Transwell 小室內培養液，棉簽擦去上室中未穿過的細胞和Matrigel 膠，95%的甲醇對細胞進行固定后使用0.1%結晶紫避光染色5 s。隨機取5 個高倍鏡視野取平均值。顯微鏡下觀察穿過微孔移到濾膜下層的細胞總數，以穿過膜底的細胞數來代表腫瘤細胞的侵襲能力。實驗獨立重復3 次，取平均數為實驗結果。

1.3.4 熒光定量PCR（qRT-PCR）應用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據說明書步驟使用SuperScript IV First-Strand 試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA。擴增條件：95 ℃預熱10 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30 次；72 ℃10 min。引物序列如下：TROP2，上游5′-TGTCCTGATGTGATATGTCTGAG-3′，下游5′-GGGTGAGAGTGGGTTGGG-3′；GAPDH，上游5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以GAPDH 為參照基因，計算TROP2 相對定量值2-△△Ct。實驗均重復3 次。

1.3.5 免疫印跡法（Western blot）每1×106個細胞加入100 μL RIPA裂解液，搖勻置于冰上30 min，每隔10 min 來回搖動EP 管，使細胞充分裂解。4 ℃下，12 000 r/min，離心5 min，取上清液轉移到另一EP 管中，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液與蛋白上樣緩沖液混合，95 ℃加熱10 min，-20 ℃保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質樣品進行分離并轉移至PVDF 膜。室溫下5 %脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃兔抗人TROP2單克隆抗體（1∶2 000）孵育過夜。PBST 漂洗三次后HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000）孵育1 h。ECLA 液和B 液按1∶1 比例混合，完全覆蓋PVDF 膜，采用ChemiDoc XRS 曝光軟件拍照后采用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測其灰度值。

1.3.6 TROP2敲減質粒的構建與鑒定通過NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）查詢TROP2 基因所有序列，根據TROP2 基因序列設計TROP2 shRNA 序列，序列為：gtgtcccaccaacaagatgac，敲減質粒以下稱為shTROP2。TROP2 敲減質粒的構建由廣州Gene-Copoeia 公司完成。將質粒轉化至DH5α感受態細胞，加入800 μL不含氨芐青霉素的LB 液體培養基，于37 ℃搖床培養60 min，200 r/min，離心3 min，取上清加入到含氨芐青霉素溶液（100 μg/mL）LB 固體培養基平板上，37 ℃的培養箱中倒置培養過夜。24 h 后挑取菌落放于1 mL 含氨芐青霉素溶液的LB 培養基中，37 ℃搖菌，次日將菌液與10 %的甘油混勻后保存于-80 ℃備用。部分菌落送南京金斯瑞生物公司測序，并根據質粒制備試劑盒說明來提取及純化質粒。

1.3.7 細胞轉染將細胞接種至六孔板內。待細胞匯合度為90% ～95%時，將4 μg 質粒DNA 加至250 μL 的OPTI-MEM 培基中，混勻。將10 μL 的Lipo2000 加至另外250 μL 的OPTI-MEM 中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將DNA 懸液和Lipo2000 懸液混合，總體積500 μL，輕輕混勻，室溫靜置20 min。將DNA 和Lipo2000 混合液加至六孔板的孔內，前后左右晃動孔板混勻，置于培養箱中培養。轉染4～6 h 后，細胞換液，每孔2 mL 培養基。

1.4 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料以（）表示，組間方差齊時采用單因素方差分析，不齊時則采用非參數檢驗，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 激光照射對HN6 細胞增殖能力的影響在相同照射時間下，低劑量組、中劑量組相對于未照射組的HN6 細胞增殖受到抑制，差異有統計學意義（P＜0.05）；高劑量組相對于未照射組，HN6 細胞的增殖能力增強，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 CCK-8 實驗結果Fig.1 The results of CCK-8 experiment

2.2 激光照射對HN6 細胞轉移影響24、48 h 兩個時間點檢測四組不同劑量激光照射細胞后劃痕，低劑量組和中劑量組劃痕寬度小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。高劑量組劃痕寬度明顯大于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。隨照射時間間隔的增加，劃痕寬度差異增大（表1、圖2）。

表1 HN6 細胞各組各時刻的劃痕寬度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

表1 HN6 細胞各組各時刻的劃痕寬度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

0 h 24 h 48 h 0 J/cm2（0 s）235.5±4.6 189.5±15.3 145.8±9.5 44.4 J/cm2（120 s）231.5±5.7 102.1±12.3 58.0±20.1 88.8 J/cm2（240 s）234.1±4.1 105.9±10.3 68.1±19.3 133.2 J/cm2（360 s）232.3±4.7 105.1±9.9 60.2±21.0 177.6 J/cm2（480 s）236.0±5.2 225.5±4.4 209.9±5.6

不同照射劑量下，細胞劃痕在0、24、48 h 時間點，三組兩兩之間差異具有統計學意義（P＜0.05）。相同劃痕時間下，低劑量vs.中劑量組與對照組vs.高劑量組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而高劑量組與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組與中劑量組相比，差異無統計學意義（P＞0.05，圖3）。結果表明，低劑量和中劑量激光照射后促進細胞轉移，高劑量激光照射后，細胞轉移受到抑制。

2.3 激光照射對HN6 細胞侵襲的影響倒置顯微鏡下觀察，44.4、88.8、133.2 J/cm2照射組與未照射組對比，細胞數量增多且密度增大；177.6 J/cm2組照射后，細胞數量減少、密度降低（圖4、5）。

2.4 激光照射對HN6細胞TROP2表達的影響激光照射HN6 細胞480 s 后，qRT-PCR 檢測HN6 細胞中TROP2 的mRNA 表達水平，低劑量組和中劑量組TROP2 的mRNA 水平高于對照組，高劑量組低于未照射組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖6）。Western blot 在蛋白水平上驗證了TROP2 的表達變化，低劑量組和中劑量組TROP2蛋白水平高于未照射組，高劑量組低于未照射組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖7、8）。

圖2 HN6 細胞劃痕實驗結果Fig.2 The results of HN6 cell scratch experiment

圖3 HN6 細胞各組各時刻的劃痕寬度柱形圖Fig.3 The bar charts of the scratch width in different groups and time of HN6 cells

2.5 抑制TROP2 表達對激光照射后細胞增殖與侵襲的影響CCK-8 實驗表明，不同劑量激光照射對轉染shTROP2 的HN6 細胞增殖的影響無差異（P＞0.05，圖9）。Transwell 實驗表明，不同劑量激光照射組中HN6 細胞侵襲性差異消失（P＞0.05，圖10）。

3 討論

口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，5 年生存率僅約50%［10-11］。目前口腔鱗癌的治療主要是采取以手術為主的綜合序列治療［12-13］，包括手術治療、化學治療、放射治療、靶向治療或綜合序列治療等［14-15］，當前的治療方式雖然提高口腔鱗癌患者的5 年存活率，但仍然約30%的患者因局部復發或轉移而導致治療失敗［16-17］。因此，非侵入性、非創傷性的治療方式已成為口腔癌輔助治療的方向，優化的治療方式亟需進一步研究并應用于臨床。

圖4 細胞侵襲實驗結果Fig.4 Results of cell invasion experiment

圖5 細胞侵襲實驗各組對比柱形圖Fig.5 The bar charts of cell invasion test groups

圖6 qRT-PCR 檢測各組細胞中TROP2 mRNA 表達Fig.6 TROP2 mRNA expression in each group was detected by qRT-PCR

圖7 Western blot 檢測各組細胞中TROP2 蛋白表達Fig.7 TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

圖8 Western blot 檢測各組細胞中TROP2 蛋白表達的灰度統計圖Fig.8 Gray-scale statistical image of TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

圖9 CCK-8 檢測轉染干擾質粒后各組細胞增殖情況Fig.9 Cell proliferation in each group was detected by CCK-8 after transfection with interfering plasmids

圖10 Transwell實驗檢測轉染干擾質粒后各組細胞侵襲情況Fig.10 Cell invasion in each group was detected by Transwell assay after transfection with interfering plasmids

Nd：YAG激光屬于近紅外激光，波長為1 064 nm，分為連續式和脈沖式兩種［18］，能分散或滲透到生物組織中［19］，Nd：YAG 激光具有選擇性光熱作用，能減少對周圍正常組織的熱損傷［20］，減輕瘢痕等不良反應的發生，且其具備高效的軟硬組織切割能力和止血殺菌作用，已被廣泛運用到口腔治療中［21］。本研究首次通過不同劑量激光調控TROP2作用于口腔鱗癌細胞以探討抑制口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的合適激光劑量及可能的作用機制，為口腔鱗癌的輔助治療提供一定的理論基礎。

本實驗通過研究口腔鱗癌細胞在不同劑量Nd：YAG 激光照射下的增殖、遷移和侵襲情況，尋找對抑制口腔鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲的有效劑量。細胞增殖實驗結果顯示，相同照射時間下的低劑量組、中劑量組相對于對照組促進HN6 細胞增殖，高劑量組相對于對照組抑制HN6 細胞增殖。劃痕實驗結果發現，相同照射時間下，低劑量組和中劑量組劃痕寬度小于對照組，高劑量組劃痕寬度大于對照組，且隨照射時間間隔的增加，劃痕寬度差異增大。侵襲實驗結果發現，鏡下觀察低劑量和中劑量激光照射后細胞穿膜數量增多，侵襲能力提高，高劑量激光照射后穿膜數量減少，侵襲能力受到抑制。結果說明，不同劑量的Nd：YAG 激光對口腔鱗癌細胞HN6 的生物學行為影響不一，選擇合適劑量的Nd：YAG 激光能對口腔鱗癌細胞的增殖、遷移與侵襲產生抑制作用，有助于作為無創傷性的治療手段輔助治療口腔鱗癌。

TROP2在實體腫瘤細胞中普遍高表達，可以促進細胞的異常增殖，還參與了多種腫瘤的侵襲和轉移，并與預后有關［22-23］。本研究發現低劑量組和中劑量組的激光照射能夠促進細胞中的TROP2 表達，高劑量激光照射可抑制細胞的TROP2 表達。干擾TROP2表達后，低劑量組和中劑量組激光照射對口腔鱗癌細胞增殖和侵襲的促進作用消失。上述研究結果表明，Nd：YAG 激光可以通過調控TROP2的表達影響口腔鱗癌細胞的增殖、侵襲與轉移。

目前研究發現，Nd：YAG 激光有效穿透深度約4 mm，對于＜4 mm 的口腔鱗癌組織可起到治療作用，但尚不能對＞4 mm 深度的口腔鱗癌組織進行有效的治療，但是可考慮作為術前輔助治療，從腫瘤周圍正常組織0.5 ～1.0 cm 先照射，逐漸移向中心［24-25］，使后期手術適當縮小腫瘤直徑，保留一些合適的組織，盡可能的減少患者的面容破壞，提高患者的生存質量。

綜上所述，不同劑量的Nd：YAG 激光對口腔鱗癌細胞HN6 進行照射時，較小劑量的Nd：YAG激光在一定劑量范圍內促進HN6 細胞的增殖、遷移和侵襲；較高劑量的Nd：YAG 激光在一定劑量范圍內有抑制鱗癌細胞HN6 增殖、遷移和侵襲，Nd：YAG 激光通過調節TROP2 干預口腔鱗癌細胞HN6 的增殖與侵襲。后期將增加口腔鱗癌細胞的種類并加入TROP2 干預進一步研究適宜的激光劑量，在不改變細胞形態的基礎上，以期能對口腔鱗癌細胞的增殖、遷移、侵襲和分子機制方面提供更加科學的理論依據，并應用于指導臨床上Nd：YAG 激光治療和免疫治療的安全操作。