circ_NEK6靶向miR-370-3p對分化型甲狀腺癌131I耐受細胞惡性生物學行為的影響

陳富坤 鄧智勇 劉超 呂娟 賈莉 楊傳周 劉鵬杰 馮志平

1云南省腫瘤醫院核醫學科（昆明650118）；2昆明醫科大學第三附屬醫院核醫學科（昆明650118）

分化型甲狀腺癌（DTC）是最常見的內分泌惡性腫瘤，雖然僅占全身惡性腫瘤的2.6%，但近年來發病率迅速增長［1］。放射性核素131I 是治療DTC 的有效方法［2］。然而，由于DTC 細胞對131I 發生繼發性放療抵抗，導致放療后病灶殘留、增殖和轉移，無法達到預期治療效果。研究［3］發現，環狀RNA（circRNA）的異常表達與腫瘤的放療抵抗密切相關。例如，circ_CCDC66［4］和circ_MTDH.4［5］參與調控腫瘤放療抵抗。前期研究［6］證實，circ_NEK6 在甲狀腺癌組織和細胞系中異常高表達，但其在DTC 細胞131I 耐受的作用機制尚不清楚。此外，在線生物學數據庫顯示，miR-370-3p 作為circ_NEK6的潛在靶基因之一，且miR-370-3p 在多種惡性腫瘤發展進程中作為抑癌基因，包括甲狀腺癌［6］、宮頸癌［7］和白血病［8］，同時，miR-370-3p 也參與調控惡性腫瘤細胞的放療耐受性［9］。然而，circ_NEK6通過靶向miR-370-3p 調控DTC 的131I 放療抵抗分子機制尚不清楚。因此，本研究擬探討circ_NEK6對131I 耐受DTC 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響以及其潛在作用機制，以期為臨床治療131I 放療抵抗的DTC 患者提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集2016 年5 月至2019 年5 月于云南省腫瘤醫院核醫學科救治的DTC 患者經手術切除的組織標本。納入標準：（1）病理證實為DTC；（2）行甲狀腺全切或次全切除；（3）首次接受131I 治療；（4）預期生存期不低于1 年。排除標準：（1）治療前血常規異常者；（2）接受過其他免疫治療或者放化療者；（3）心臟、肝、腎等重要臟器功能出現嚴重不全者。此外，根據中華醫學會核醫學會公布的131I 治療DTC 指南（2014 版）［10］，將患者分為131I 敏感組（20 例）和131I 耐受組（20 例）。其中131I耐受組評判標準［11］：（1）轉移灶在清甲成功后首次131I 治療后全身顯像中即表現為不攝碘；（2）原本攝碘的功能性轉移灶經131I治療后逐漸喪失攝碘能力；（3）部分轉移灶攝碘，而部分轉移灶不攝碘，且可被18F-FDG PET/CT、CT 或MRI 等其他影像學檢查所顯示；（4）攝碘轉移灶在經多次131I 治療后雖然保持攝碘能力，但仍在1年內出現病情進展的患者。131I敏感組評判標準［11］：甲狀腺癌術后經131I治療后殘留甲狀腺組織清甲完全。所有組織標本取出后立即儲存于-80 ℃冰箱保存備用。手術前均告知患者并簽署知情同意書，并獲得本醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞系和主要試劑人DTC 細胞、人甲狀腺濾泡上皮細胞以及HEK-293T 均購自北納生物；DMEM 和Trizol 試劑盒購自Thermo 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；LipofectamineTM3000 和逆轉錄試劑盒購自TaKaRa 公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell 小室購自康寧公司；雙熒光素酶報告基因購自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、分組及轉染采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM 培養上述細胞系。待Res-BCPAP 細胞生長密度達到80%時，將細胞調整密度2 × 105個/孔平鋪到6 孔板中，嚴格參照LipofectamineTM3000 試劑說明書進行轉染處理，分為敲降circ_NEK6 組、敲降miR-370-3p 組、同時敲降circ_NEK6+miR-370-3p inhibitor 組，轉染培養6 h后，更換正常DMEM 繼續培養用于后續實驗。

1.2.2131I 耐受細胞構建參考前期文獻［12］，將對數生長期的BCPAP 細胞置于0.5 mCi 放射性核素131I 照射下培養24 h。更換新鮮的DMEM 繼續培養，并觀察細胞活力，若無明顯死亡則選擇該對數期細胞增加劑量，反復傳代培養，直至最后在131I（1.05 mCi）照射下能夠穩定存活，即構建成功131I放療抵抗細胞株Res-BCPAP。

1.2.3 RT-qPCR收集組織和細胞，采用Trizol提取總RNA，并采用NanoDrop 檢測RNA的濃度。隨后，采用一步法逆轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，嚴格按照qPCR 試劑盒說明書檢測circ_NEK6 和miR-370-3p 的表達，以U6 和GAPDH 為內參。

1.2.4 細胞增殖檢測將處理的Res-BCPAP 細胞培養至對數生長期，以每孔1 × 105個細胞接種96孔板，每組設置6 個復孔，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養0、24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液（0.5 mg/mL）后繼續于培養箱中孵育4 h 后，采用酶標儀檢測450 nm 處的每孔光密度（OD450）值。

1.2.5 細胞凋亡檢測將經轉染后的細胞調整濃度為1 × 105個/孔接種到6 孔板，過夜培養后用胰蛋白酶消化細胞，PBS 洗滌后加入300 μL 結合液重懸，加入10 μL Annexin V-FITC 室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI 溶液染色，混合均勻后避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡百分比。

1.2.6 細胞侵襲和遷移檢測將經轉染處理的細胞，以1 × 105個/孔的濃度接種于Transwell 小室上室，下室加入500 μL DMEM后常規培養24 h。培養結束后采用1%結晶紫染色20 min，并于光學顯微鏡下隨機選擇5 個視野計算侵襲和遷移細胞數。對于侵襲實驗，Transwell 小室上室需采用Matrigel膠包被，其他實驗與遷移實驗步驟一致。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗由湖南普拉特澤生物科技有限公司構建circ_NEK6 基因的3′UTR，插入pGL3-Promoter 質粒載體中，將該重組質粒命名為pGL3-circ_NEK6-3′UTR WT，采用基因突變法定點突變獲得circ_NEK6 突變型載體（pGL3-circ_NEK6-3′UTR MUT）。然后，將HEK-293T 細胞接種于12 孔板中，待細胞匯合度達到70%時分別將miR-370-3p mimic、miR-NC、circ_NEK6 野生型載體、circ_NEK6 突變型載體共轉染于細胞中，轉染6 h 后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM 培養液，繼續培養36 h。最后，采用雙熒光素酶報告基因檢測熒光素酶活。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 對所有數據進行統計學分析，并利用GraphPad Prism 8 對實驗數據進行繪圖。其中兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_NEK6在DTC組織和細胞系中高表達RT-qPCR結果顯示，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 組織中的表達明顯高于敏感組織（P＜0.001，圖1A）。相比于Nthy-ori3-1 細胞，circ_NEK6 在DTC 細胞系中高表達（P＜0.001，圖1B），特別是在BCPAP細胞。此外，circ_NEK6 在Res-BCPAP 細胞中的表達高于其親本細胞BCPAP（P＜0.01，圖1C）。由此可知，circ_NEK6 的高表達可能與DTC 的131I 耐受相關。

2.2 敲降circ_NEK6 可顯著抑制Res-BCPAP 細胞增殖和誘導細胞凋亡相比于對照組，敲降circ_NEK6 可下調Res-BCPAP 細胞中circ_NEK6 的表達（P＜0.001，圖2A）。同時，敲降circ_NEK6 組細胞增殖受到抑制（圖2B），凋亡百分數上調（P＜0.001，圖2C、D）。

圖1 circ_NEK6 在DTC 組織和細胞系中的表達水平Fig.1 The expression of circ_NEK6 in DTC tissues and cell lines

圖2 敲降circ_NEK6 對Res-BCPAP 細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell proliferation and apoptosis

2.3 敲降circ_NEK6可顯著抑制Res-BCPAP細胞侵襲和遷移能力Transwell 檢測結果顯示，相比于對照組，敲降circ_NEK6 組Res-BCPAP 細胞侵襲（圖3A）和遷移能力（圖3B）顯著下調（均P＜0.001）。

圖3 敲降circ_NEK6 對Res-BCPAP 細胞侵襲和遷移能力的影響Fig.3 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell invasion and migration abilities

2.4 circ_NEK6 靶向下調miR-370-3p 的表達Starbase 數據庫預測顯示，miR-370-3p 與circ_NEK6存在結合位點（圖4A）。同時，miR-370-3p 在Res-BCPAP 細胞中的表達水平明顯低于其親本細胞（P＜0.001，圖4B）。雙熒光素酶報告基因結果顯示，過表達miR-370-3p 顯著下調野生型circ_NEK6載體的熒光素酶活性（P＜0.01，圖4C），但對突變型circ_NEK6 載體沒有影響。此外，miR-370-3p 在敲降circ_NEK6組中的表達高于si-NC組（P＜0.01，圖4D）。由此可知，circ_NEK6靶向負調控miR-370-3p 的表達。

2.5 敲降circ_NEK6 靶向上調miR-370-3p 抑制Res-BCPAP細胞惡性生物學行為相比于對照組，miR-370-3p在miR-370-3p inhibitor組中的表達下調（P＜0.001，圖5A），但回復組（miR-370-3p inhibitor和si-NEK6）上調miR-370-3p的表達（P＜0.001）。相比于敲降circ_NEK6 組，細胞增殖活力（圖5B）明顯上調，細胞凋亡水平下調明顯（P＜0.001，圖5C、D）。Transwell檢測結果顯示，相比于敲降circ_NEK6 組，回復組細胞侵襲（P＜0.001，圖5E、G）和遷移（P＜0.001，圖5F、H）能力明顯上調。由此可知，敲降circ_NEK6 通過靶向上調miR-370-3p 的表達水平，進而抑制Res-BCPAP 細胞增殖、侵襲和遷移能力，以及誘導細胞凋亡。

圖4 miR-370-3p 是circ_NEK6 的靶基因Fig.4 miR-370-3p was a target gene of circ_NEK6

圖5 circ_NEK6 靶向miR-370-3p 對Res-BCPAP 細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響Fig.5 Effect of circ_NEK6 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration capacities of Res-BCPAP cells via targeting miR-370-3p

3 討論

大量文獻［13-15］證實非編碼RNA（包括miRNA、lncRNA 和circRNA）通過調控腫瘤細胞惡性生物行為介導多種惡性腫瘤放療抵抗。尤其是circRNA可作為惡性腫瘤放療抵抗的重要調控因子［16］。例如，經放療處理的宮頸癌細胞中有153 個差異circRNA異常表達（其中76個上調和77個下調）［17］。GUAN 等［18］證實，敲降circ_PITX1 通過靶向抑制miR-329-3p 促進膠質瘤細胞對放療的敏感性。LIU 等［19］研究表明，敲降circ_100367 通過抑制放療抵抗KYSE-150R 細胞增殖、侵襲和遷移，從而緩解食管鱗狀細胞癌細胞對放療的抵抗。本研究同樣證實，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 組織和細胞系中異常高表達，敲降circ_NEK6 通過靶向上調miR-370-3p 顯著抑制了131I 耐受細胞增殖、侵襲和遷移能力。同時，LIU 等［20］也證實，lncRNA MEG3 通過靶向miR-182 增強甲狀腺癌細胞對131I 的敏感性。

大量研究證實，circRNA 通過靶向結合下游miRNA 參與調控惡性腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。例如，circ_AGFG1 通過靶向抑制miR-370-3p 促進宮頸癌細胞增殖和遷移能力［7］。circ_MYO10 通過抑制miR-370-3p 促進骨肉瘤細胞增殖和上皮間質轉化，進而加速腫瘤的惡化進程［21］。miR-370-3p作為抑癌基因，在多種惡性腫瘤組織和細胞系中低表達［22］。過表達miR-370-3p 可明顯抑制腫瘤細胞惡性生物學行為［23］，進而增強腫瘤細胞對放療敏感性［9］。然而，目前尚未有研究證實miR-370-3p在DTC 細胞對131I 耐受過程中的作用機制。本研究結果顯示，miR-370-3p 在131I 耐受Res-BCPAP 細胞中的表達低于BCPAP 細胞，且敲降miR-370-3p 可緩解circ_NEK6 敲降對Res-BCPAP 細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。也有研究表明，過表達miR-370-3p 增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［24］。以上研究提示，miR-370-3p 可能是增強DTC 對131I 放射敏感性的有效性靶點。

綜上所述，本研究證實circ_NEK6/miR-370-3p分子軸與DTC 細胞對131I 耐受有關，敲降circ_NEK6通過靶向上調miR-370-3p 顯著抑制Res-BCPAP 細胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究為臨床上治療DTC 患者對131I 放射性粒子植入治療產生抵抗提供有效的治療靶點。