褪黑素通過調(diào)控EZH2表達(dá)增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性

秦文兵 張?jiān)蔓?劉嘉 李瑞佳 張銳

1西安市第八醫(yī)院藥劑科（西安710000）；2鄭州市中心醫(yī)院臨床藥學(xué)科（鄭州450007）；3陜西省腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（西安710000）

在世界范圍內(nèi)，食管癌的發(fā)生率位列惡性腫瘤第八位，死亡率為第六位［1］。根治性手術(shù)是食管癌治療的首選，但80%的食管癌患者在確診時(shí)已失去手術(shù)的機(jī)會(huì)［2-3］。因此放療或者化療是中晚期食管癌患者維持治療的主要方式［4］。5-氟尿嘧啶（5-FU）是食管癌臨床化療最常用的藥物之一［5］。5-FU 的主要作用機(jī)理是通過不可逆性抑制胸苷酸，干擾DNA 的合成。5-FU 對(duì)正常細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生毒性，同時(shí)癌細(xì)胞對(duì)5-FU 容易產(chǎn)生抵抗性。因此，尋找其他藥物試劑與5-FU 聯(lián)合使用，提供更多有效的方法使癌細(xì)胞對(duì)化療敏感，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性是非常必要的。

褪黑素（melatonin，MLT）是哺乳動(dòng)物和人類松果體內(nèi)產(chǎn)生的一種胺類激素。近年來，國內(nèi)外的研究［6-8］發(fā)現(xiàn)褪黑激素具有促進(jìn)睡眠、調(diào)節(jié)時(shí)差、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多項(xiàng)生理功能。也有研究［9-11］表明褪黑素能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖周期和凋亡等生物學(xué)功能。研究［12-14］已經(jīng)證明褪黑素能夠通過增加對(duì)腫瘤化療藥物的敏感性、降低耐藥率提高藥物的療效，并且能夠降低化療藥物的毒性。同時(shí)褪黑素與化療藥物聯(lián)合使用能夠提高化療藥物的療效［15-16］。但是，目前在食管癌中褪黑素對(duì)5-FU 化療敏感性的影響及相關(guān)作用機(jī)制的研究還很缺乏。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑人食管癌細(xì)胞株EC-9706和EC-109 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。褪黑素和5-FU 購自美國Sigma 公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購于HyClone公司。一抗Bcl-2、Mcl-1、EZH2和二抗購于Abcam 公司。CCK-8 試劑盒、蛋白提取試劑盒、凋亡檢測試劑盒和ECL 發(fā)光試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人食管癌細(xì)胞株EC-9706和EC-109細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照說明書，使用脂質(zhì)體3000 進(jìn)行pc-DNA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。

1.3 CCK-8 檢測細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5 × 104/mL，96 孔板每孔接種量為100 μL，37 ℃孵育過夜。24 h 后，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70% ～80%時(shí)，加入含有不同藥物的新鮮培養(yǎng)基，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。藥物作用24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm 處檢測細(xì)胞吸光度（OD）值。細(xì)胞活性（%）=（加藥組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.4 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲遷移收集細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸。Transwell 遷移試驗(yàn)中，將含有5 × 104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基直接接種于Transwell上室中。侵襲實(shí)驗(yàn)，前一天在Transwell 的上室中預(yù)鋪基質(zhì)膠（BD biosciences）。Transwell 下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃孵育24 h后，對(duì)已遷移或侵襲膜下表面的細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫（Sigma）染色20 min。在顯微鏡下觀察5 個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)和成像。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡不同藥物處理EC-9706 細(xì)胞24 h 后，收取細(xì)胞，PBS 洗滌，室溫1 700 r/min離心5 min，棄上清，后加入400 μL Binding Buffer，重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，室溫放置15 min，再加入10 μL PI，輕柔混勻后置于冰上避光5 min，之后使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 Western blot 檢測收取細(xì)胞，提取蛋白并測定濃度。每孔上樣量為30 μg，將樣品進(jìn)行凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入Bcl-2、Mcl-1、EZH2 一抗4 °C 孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min；二抗室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min；ECL 發(fā)光，Bio-Rad 成像儀成像。圖像用Image J 1.48 軟件對(duì)各蛋白條帶進(jìn)行灰度值定量分析，以GAPDH 蛋白表達(dá)為內(nèi)參，分析各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）Trizol 法（Invitrogen，USA）從細(xì)胞和組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，應(yīng)用2-△△ct法計(jì)算結(jié)果。

1.8 荷瘤實(shí)驗(yàn)將12只4 ～6周齡BALB/c雄性裸鼠［體質(zhì)量約（20±2）g］隨機(jī)分為兩組：A組為5-FU組（20 mg/kg），B 組為褪黑素與5-FU 聯(lián)合組（25 mg/kg+ 20 mg/kg）。用PBS 將EC-9706 細(xì)胞調(diào)整為1 ×107/mL 的濃度，在無菌的條件下，用1 mL 注射器皮下注射100 μL 細(xì)胞懸液于裸鼠右側(cè)腋下。裸鼠接種后的第8 天開始給藥處理，每兩天給藥1 次。從接種開始，每隔一天測量裸鼠體重、腫瘤體積。在第23 天處死裸鼠并剝離腫瘤組織、稱重。

1.9 免疫組化用S-P 法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。加抗EZH2（1∶200 稀釋）的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，加二抗（1∶2 000 稀釋），顯色并復(fù)染，設(shè)置對(duì)照。高倍顯微鏡下（×400）每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)不同的視野，測定光密度值并計(jì)算平均值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計(jì)量資料組間分析采用t檢驗(yàn)，多組之間采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 軟件（SPSS，Chicago，IL，USA），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素增強(qiáng)5-FU 抑制食管癌細(xì)胞增殖的能力CCK-8 結(jié)果顯示，褪黑素對(duì)EC-9706 和EC-109細(xì)胞活力的抑制呈劑量依賴性（P＜0.01，圖1A、B）；同時(shí)，5-FU 對(duì)EC-9706 和EC-109 細(xì)胞活力的抑制也呈劑量依賴性。褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)5-FU處理相比，褪黑素顯著增強(qiáng)5-FU介導(dǎo)的對(duì)EC-9706 和EC-109 細(xì)胞活力抑制的能力（P＜0.01，圖1C、D）。同時(shí)，與褪黑素聯(lián)合治療顯著增加食管癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，與單獨(dú)5-FU處理組相比，其IC50值顯著下降（P＜0.01，圖1E）。

圖1 褪黑素和5-FU 單獨(dú)或聯(lián)合對(duì)食管癌細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of melatonin and 5-FU alone or combined on the cell viability in esophageal carcinoma cells

2.2 褪黑素聯(lián)合5-FU在不同時(shí)間對(duì)食管癌細(xì)胞活力的影響根據(jù)褪黑素單獨(dú)處理食管癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞活力影響的結(jié)果，選擇1 mmol/L 的褪黑素進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)；根據(jù)食管癌細(xì)胞中5-FU的IC50值，選擇40 μmol/L 的5-FU 處理EC-9706 細(xì)胞，60 μmol/L的5-FU 處理EC-109 細(xì)胞。褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)褪黑素和5-FU 處理組比較，對(duì)細(xì)胞活力的抑制明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。接著，分別在24、48、72 h 檢測了褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理對(duì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)褪黑素和5-FU 處理組比較，顯著增加對(duì)細(xì)胞活性的抑制（P＜0.01），見圖2。

2.3 褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞侵襲遷移的影響Transwell 結(jié)果顯示，與DMSO 處理組比較，褪黑素處理組細(xì)胞侵襲和遷移的數(shù)量明顯減少（P＜0.01）。褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)褪黑素和5-FU 處理組比較，細(xì)胞侵襲和遷移的數(shù)量也顯著降低（P＜0.01），見圖3。

2.4 褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與DMSO 組比較，褪黑素處理組細(xì)胞的凋亡率顯著增加（P＜0.01）。褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)褪黑素和5-FU處理組比較，細(xì)胞的凋亡率也顯著增加（P＜0.01，見圖4A、B）。Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，褪黑素處理組蛋白Bcl-2 和MCL-1 的表達(dá)也顯著降低（P＜0.01）；褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)褪黑素和5-FU 處理組比較，蛋白Bcl-2 和MCL-1的表達(dá)也顯著降低（P＜0.01，圖4C、D）。

2.5 褪黑素增強(qiáng)5-FU 對(duì)食管癌中EZH2 表達(dá)的抑制與DMSO 組比較，褪黑素處理組EZH2 的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理組，與單獨(dú)MLT 和5-FU 處理組比較，在mRNA和蛋白水平均能顯著降低EZH2 的表達(dá)（P＜0.01，圖5A、B）。過表達(dá)EZH2 的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，過表達(dá)EZH2 能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞活力、侵襲遷移和凋亡的影響（P＜0.01，圖5C、D、E）。

2.6 褪黑素促進(jìn)5-FU 對(duì)裸鼠食管癌移植瘤生長的抑制體內(nèi)移植瘤結(jié)果顯示，在移植瘤實(shí)驗(yàn)的第23 天，與單獨(dú)5-FU 給藥組比較，褪黑素和5-FU聯(lián)合給藥組顯著增強(qiáng)對(duì)移植瘤生長的抑制，腫瘤的體積和重量均有所減少（P＜0.01，圖6A、B）。免疫組化、qRT-PCR 和Western blot 結(jié)果均顯示，與單獨(dú)5-FU 給藥組比較，褪黑素和5-FU 聯(lián)合給藥組中EZH2的表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖6C、D、E）。

3 討論

圖2 褪黑素聯(lián)合5-FU 在不同時(shí)間對(duì)食管癌細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of combination of melatonin and 5-FU on cell viability in esophageal carcinoma cellsat different time

圖3 褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞侵襲遷移的影響Fig.3 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on cell invasion and migration inEC-9706 cells

早期食管癌的臨床癥狀不明顯，難于被發(fā)現(xiàn)；以控制播散為目的的化療在食管癌的治療方法中占有重要的地位。雖然化療藥物的研發(fā)已取得巨大進(jìn)展，但是在臨床實(shí)踐中，化療藥物耐藥仍時(shí)常發(fā)生，并已成為食管癌治療失敗的重要原因之一［17］。5-FU作為食管癌治療的一線化療藥物，也面臨藥物毒副作用和耐藥的難題。近期研究［11-12，14］發(fā)現(xiàn)褪黑素在多種腫瘤中具有抗腫瘤的作用，包括胰腺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。研究又發(fā)現(xiàn)褪黑素與化療藥物合用能夠影響化療藥物的療效。通過夜間光照誘導(dǎo)生理性褪黑素合成的紊亂，能夠抑制腫瘤抑制基因ARHI 的表達(dá)并介導(dǎo)stat3 驅(qū)動(dòng)的乳腺癌紫杉醇耐藥［13］。也有研究［16］發(fā)現(xiàn)，褪黑素及其代謝物能夠增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的化學(xué)敏感性。因此，在食管癌中，褪黑素與5-FU 合用能否提高5-FU 的化療敏感性、降低細(xì)胞毒性是本次研究的目的。

有研究［18-19］表明褪黑素能夠降低膀胱癌和結(jié)直腸癌的細(xì)胞活性并且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。本研究也發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠降低食管癌細(xì)胞EC-9706 和EC-109 的活性并且呈劑量依賴性。劉玲玲等［20］的研究也發(fā)現(xiàn)，隨著褪黑素濃度的逐漸提高，對(duì)EC-109 的抑制作用明顯提高，這與本研究結(jié)果是一致的。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)聯(lián)合褪黑素能夠顯著提高5-FU 對(duì)EC-9706 和EC-109 細(xì)胞活力的抑制。研究［19］表明，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中褪黑素可增強(qiáng)5-FU 對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制。另外，聯(lián)合褪黑素能夠顯著降低食管癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的IC50值。以上結(jié)果表明，聯(lián)合褪黑素能夠增加食管癌細(xì)胞對(duì)5-FU 的敏感性。

圖4 褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on cell apoptosis inEC-9706 cells

圖5 褪黑素聯(lián)合5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞中EZH2 表達(dá)的影響Fig.5 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on EZH2 expression in EC-9706 cells

本研究結(jié)果提示褪黑素和5-FU 對(duì)食管癌細(xì)胞的敏感性和毒性的影響與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。Bcl-2 和Mcl-1 是重要的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2 和Mcl-1 蛋白的表達(dá)能夠抵抗腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究表明褪黑素能夠顯著提高5-FU 介導(dǎo)的抑制凋亡抵抗蛋白Bcl-2 和Mcl-1 的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)食管癌細(xì)胞的凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，褪黑素和5-FU 聯(lián)合能夠顯著降低食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，這也為臨床上褪黑素和5-FU 聯(lián)合使用抑制食管癌的進(jìn)展提供了進(jìn)一步的理論支持。此外，荷瘤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)聯(lián)合褪黑素和5-FU 能夠顯著抑制食管腫瘤的生長。

圖6 褪黑素協(xié)同5-FU 在體內(nèi)抑制食管癌的生長Fig.6 Melatonin combined with 5-FU inhibited the growth of esophageal cancer in vivo

Zeste 基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog2，EZH2）是多梳蛋白抑制復(fù)合體2 的催化亞基，能夠抑制相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來的研究［21-24］發(fā)現(xiàn)，EZH2 在多種腫瘤中高表達(dá)，并證實(shí)EZH2 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用。研究也證明EZH2是一個(gè)很有潛力的治療靶標(biāo)［25-26］。本研究發(fā)現(xiàn)褪黑素和5-FU 聯(lián)合處理食管癌細(xì)胞能夠顯著降低EZH2的表達(dá)，過表達(dá)EZH2 能夠逆轉(zhuǎn)褪黑素協(xié)同5-FU 對(duì)EC-9706 細(xì)胞特性的影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了褪黑素協(xié)同5-FU 通過降低EZH2 的表達(dá)抑制食管腫瘤的生長。

綜上所述，褪黑素和5-FU 協(xié)同抑制EZH2 的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高食管癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。盡管褪黑素增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性的詳細(xì)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究，但是本研究為對(duì)5-FU 耐藥的治療提供了初步的理論依據(jù)，并為5-FU 的聯(lián)合治療提供了新思路。