基質金屬蛋白酶2、整合素-金屬蛋白酶17及上皮性鈣粘附蛋白E在結直腸癌癌組織中的表達及臨床意義

徐輝 唐言華 劉繼武 王亮

貴陽市第一人民醫院胃腸外科（貴陽550002）

結直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發病率僅次于胃癌和食道癌，隨著我國人口老年化加劇，其發病率也在逐漸增加。由于結直腸癌發生部位較為隱蔽，使得大部分結直腸癌患者確診時多為中晚期且常伴有轉移，患者5 年生存率較低。隨著對結直腸癌早期篩查診斷的深入研究以及靶向藥物的應用，患者治愈率明顯提高，生存情況明顯改善［1-2］。因此，深入了解結直腸癌發生、發展以及轉移過程中的分子機制，為結直腸癌早期診斷與治療提供可靠依據具有重要意義。基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中的重要成員，可降解細胞外基質和基底膜，促進腫瘤細胞浸潤、轉移［3-4］。研究表明，MMP-2 在結直腸癌進展、轉移過程中發揮重要作用，結直腸癌中MMP-2 表達高于相鄰正常黏膜［5］。整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）是一種具有蛋白剪切酶樣作用的糖蛋白，可水解釋放多種配體，參與細胞信號轉導，介導腫瘤發生發展與轉移途徑［6］。DENG 等［7］研究表明，ADAM17 能夠促進結腸癌發生，可能成為結腸癌治療中的藥物靶點。上皮性鈣粘附蛋白E（E-cadherin）作為鈣粘蛋白家族的重要成員，可穩定細胞骨架及用于維持細胞-細胞間的相互作用，在完全分化的癌組織中，E-cadherin 高度表達，且腫瘤細胞侵襲、轉移性降低，患者預后良好［8］。文獻資料報道顯示，細胞膜E-cadherin 表達減少預示著結直腸癌患者生存率低下［9］。為進一步研究MMP-2、ADAM17 和E-cadherin 在結直腸癌中的臨床意義，本研究通過探討MMP-2、ADAM17 及Ecadherin 在結直腸癌與癌旁組織中的表達情況，并分析其與結直腸癌臨床病理特征間的關系以及與結直腸癌預后的關系，并分析MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 之間相關性，旨在為結直腸癌分子靶向治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院2011年1月至2014年1月結直腸癌手術患者的新鮮標本（包括癌組織與距腫瘤至少5 cm 的癌旁組織）以及對應的石蠟切片組織210 例，其中男116 例，女94 例，年齡41 ～80 歲，平均（59.02 ± 10.36）歲。TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期137 例，Ⅲ、Ⅳ期73 例。納入標準：（1）所有患者病理確診為原發性結直腸癌；（2）均為首發病例；（3）術前均未接受新輔助化療。排除標準：（1）合并其他部位原發性腫瘤患者；（2）排除肺轉移、腹膜轉移者；（3）臨床資料不完整者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色所有標本連續切片，經脫臘水化后，加H2O2室溫孵育20 min，再用PBS 漂洗3 min，滴加血清封閉1 h，加一抗4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 漂洗，甩干滴加二抗，室溫孵育30 min，洗去二抗，滴加DAB 顯色，清水沖洗，蘇木精染核5 min，沖洗，分化液分化1 s，流水沖洗5 min，梯度酒精復水，用中性樹膠封片。結果判定：MMP-2、ADAM17 主要表達于細胞質，細胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞；E-cadherin 主要表達于細胞膜，細胞膜上出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，根據著色細胞占視野細胞總數的百分比以及著色細胞染色強弱評分的乘積綜合評分。

1.2.2 Western blot 檢測MMP-2、ADAM17 及Ecadherin 蛋白表達提取結直腸癌組織以及對應的癌旁組織，操作嚴格按步驟進行，用BCA 法測定蛋白濃度進行蛋白定量，依照目標蛋白分子大小制定不同濃度分離膠，將配置好的膠板安置到電泳槽內，上樣電泳，電泳完成后進行轉膜、封閉、雜交，在電子凝膠成像系統下顯影、拍照，以β-actin為內參蛋白，運用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的條帶的灰度值/內參條帶的灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 隨訪情況采用門診方式隨訪5年，至2019年1 月，第1 年每3 個月隨訪一次，2 ～5 年每6 個月隨訪1 次，記錄患者總生存率和中位生存期。

1.4 統計學方法使用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用（）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Spearman 秩和檢驗分析，生存分析用Kaplan-Meier 法，生存率比較用Log-rank 檢驗，以（%）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌和癌旁組織免疫組化染色情況比較MMP-2 陽性表達于癌細胞質，呈棕黃色顆粒，MMP-2 在癌組織中的陽性表達率為72.38%（152/210）顯著高于癌旁組織的19.52%（41/210），差異有統計學意義（P＜0.05）；ADAM17 陽性表達于癌細胞質，呈棕黃色顆粒，在癌旁組織中無表達或僅有少量表達，210 例癌旁組織中僅有11 例（陽性率為5.24%）呈弱陽性表達，其余均為陰性，在癌組織中，ADAM17陽性表達率為78.10%（164/210），差異有統計學意義（P＜0.05）；E-cadherin 陽性表達于細胞膜內，在癌組織中的陽性表達率為41.90%（88/210）顯著低于癌旁組織的96.67%（203/210），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌和癌旁組織免疫組化染色情況比較（SP 染色，×400）Fig.1 Comparison of immunohistochemical staining of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

2.2 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌和癌旁組織中的蛋白表達水平比較Western Blot結果顯示，癌組織中的MMP-2、ADAM17 蛋白表達水平顯著高于癌旁組織，E-cadherin蛋白表達水平顯著低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 陽性表達與TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移有關（P＜0.05），與患者性別分布、年齡、腫瘤大小、發生部位無關（P＞0.05）。見表1。

圖2 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌和癌旁組織中的蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of protein expression levels of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and adjacent tissues

表1 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌組織中的表達與臨床病理特征的關系Tab.1 Relationship between expressions of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin in colorectal cancer tissues and clinicopathological characteristics例（%）

2.4 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 表達與結直腸癌患者生存情況關系210 例結直腸癌患者中位生存期24 個月（95%CI：22.57 ～25.94），5 年生存率57.04%，MMP-2 陽性組中位生存期22 個月（95%CI：20.87 ～23.58），5年生存率53.42%，MMP-2陰性組中位生存期31個月（95%CI：28.95 ～33.45），5 年生存率69.18%，兩組生存情況比較，差異有統計學意義（Log-rank χ2= 4.98，P＜0.05）；ADAM17陽性組中位生存期21個月（95%CI：19.93 ～22.86），5 年生存率50.77%，ADAM17 陰性組中位生存期33個月（95%CI：30.48 ～36.40），5年生存率65.52%，兩組生存情況比較，差異有統計學意義（Log-rank χ2= 7.28，P＜0.05）；E-cadherin 陽性組中位生存期30個月（95%CI：27.88 ～31.32），5年生存率47.92%，E-cadherin陰性組中位生存期16個月（95%CI：14.60～17.89），5 年生存率26.09%，兩組生存情況比較，差異有統計學意義（Log-rank χ2=44.23，P＜0.05）。

圖3 MMP-2、ADAM17、E-cadherin 表達與結直腸癌患者生存情況關系Fig.3 Relationship between expressions of MMP-2，ADAM17 and E-cadherin and survival of patients with colorectal cancer

2.5 MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 在結直腸癌中表達的Spearman 相關性分析Spearman 相關性分析結果顯示，MMP-2 表達與ADAM17 表達呈正相關（r=0.494，P＜0.05），MMP-2表達與E-cadherin表達呈負相關（r=-0.368，P＜0.05），ADAM17 表達與E-cadherin表達呈負相關（r=-0.608，P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的浸潤、轉移依賴于細胞外基質的降解，MMPs 作為一類重要的水解酶，幾乎能夠降解所有的細胞外基質以及血管基底膜，促進腫瘤浸潤、轉移［10］。MMP-2 是MMPs 中的IV 型膠原酶，可降解Ⅳ、Ⅴ型膠原、層粘連蛋白等成分，破壞基膜的完整性，其活性以及表達的增加與人類多種惡性腫瘤侵襲、轉移以及預后緊密相關，是惡性腫瘤進展的標志物之一［11］。GAO 等［12］發現MMP-2 在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，其表達與腫瘤分化、侵襲深度、淋巴結轉移以及腫瘤分期有關。PENG 等［13］應用免疫組化研究發現MMP-2 在結直腸癌中表達與腫瘤浸潤、分期、淋巴結轉移以及生存率有關，且主要表達于腫瘤細胞的侵襲區域。本研究結果顯示，MMP-2 在結直腸癌組織中的陽性表達顯著高于癌旁組織，MMP-2表達與結直腸癌TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移有關，與患者性別、年齡、腫瘤大小、發生部位無相關性，且TNM 分期越晚，發生淋巴結轉移與肝轉移的危險性越大，以及分化程度越低患者表達越高，表明MMP-2 表達與結直腸癌侵襲、轉移密切相關，與以往研究結果具有一致性。Kaplan-Meier 生存分析顯示，MMP-2 陽性組生存率顯著低于陰性組，表明MMP-2陽性表達預示患者預后不佳，可能作為結直腸癌預后判斷的指標之一。

ADAM17 是一種具有蛋白剪切酶樣作用的與細胞膜結合的糖蛋白，可水解釋放多種表皮生長因子受體配體，表皮生長因子膜外部分與配體結合，激活表皮生長因子絡氨酸激酶活性并參與細胞內信號轉導途徑，調控腫瘤發生、發展與轉移［14］。PENG 等［15］研究發現，ADAM17 可調節結直腸癌細胞生長，對化療敏感性造成影響。教瑞等［16］證實，發生腫瘤細胞轉移的組織ADAM17 陽性表達率顯著高于未發生轉移的組織，其陽性表達與結直腸癌患者腫瘤浸潤深度、TNM 分期以及是否發生淋巴轉移顯著相關。本研究結果顯示，ADAM17 在結直腸癌組織中的陽性表達顯著高于相應的癌旁組織，ADAM17 表達與結直腸癌TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移有關，與患者性別分布、年齡、腫瘤大小、發生部位無相關性，且TNM 分期越晚，發生淋巴結轉移與肝轉移以及分化程度越低患者表達越高，表明ADAM17 可能在結直腸癌進展過程中發揮作用，與以往報道相符。Kaplan-Meier 生存分析顯示，ADAM17 陽達組生存率顯著低于陰性組，表明。

文獻研究數據表明，E-cadherin 在多種腫瘤組織中的表達較正常組織有不同程度下降，E-cadherin 表達降低導致腫瘤細胞間的黏附能力下降，進而與原發部位脫離，促進腫瘤浸潤、轉移［17］。本研究結果顯示，E-cadherin 在結直腸癌組織中的陽性表達顯著低于癌旁組織，E-cadherin 表達與結直腸癌TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移有關，與患者性別分布、年齡、腫瘤大小、發生部位無相關性，且TNM 分期越早，未發生淋巴結轉移與肝轉移以及分化程度越高患者表達越高。進一步使用Kaplan-Meier 生存分析顯示，陽性表達組生存率顯著低于陰性表達組，與教瑞等［16］研究結果一致。上述研究結果表明，E-cadherin 可能與結直腸癌侵襲、轉移密切相關，其陽性表達的結直腸癌患者預后不良，檢測其表達水平有望成為判斷結直腸癌患者病情的重要指標。

本研究結果還顯示，結直腸癌組織中MMP-2表達與ADAM17 表達呈正相關，E-cadherin 表達與MMP-2、ADAM17 表達呈負相關，表明以上三種蛋白聯系緊密，在結直腸癌發生、發展過程中起重要作用。YE 等［17］表明，ADAM17 通過脫落EGFR配體TGF-α，激活EGFR-MEK-ERK 信號轉導途徑，導致MMP-2、MM-9 過表達；ADAM17 還可介導多種細胞因子、生長因子以及黏附分子（如Ecadherin、N-cadherin）等的脫落，促進腫瘤轉移、浸潤［18］。研究顯示，MMPs 可裂解E-cadherin 細胞外結構，促使其成為可溶性E-cadherin，MMPs 還與細胞膜表面結構E-cadherin 代謝有關［19］。因此，MMP-2、ADAM17 上調表達，E-cadherin 下調表達，可能參與結直腸癌的進展過程，但具體的分子機制還需進一步研究。本研究為MMP-2、ADAM17及E-cadherin 成為對結直腸癌治療的靶點藥物提供了一定的理論基礎，為積極尋找其上下游因子提供了根據，從而有利于結直腸癌治療提供更多選擇，以造福更多的患者。但本次研究樣本量有限，且為單中心研究，對于MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 參與調控結直腸癌的信號通路有待深入闡明。后續可以納入更多樣本量以及開展多中心研究，還可以補充動物或者細胞實驗以進一步為本次研究提供支持。

綜上所述，MMP-2、ADAM17 及E-cadherin 對結直腸癌的發生、發展具有重要的意義，其表達水平與患者預后密切相關，研究三者的相關性將有助于加深對結直腸癌侵襲、轉移分子機制的理解，對于結直腸癌治療以及預后評估有一定的價值。