PYCR1基因在肝細胞癌中的表達及與預后的關系

程秋華 周帥 向楊 楊樹龍 符國珍

中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院肝膽外科（海口570208）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌，在肝硬化患者中多見［1］。在過去的二十年中，HCC 的發病率和死亡率居高不下，大多數HCC 患者發生在東亞、東南亞和非洲等地區［2］。HCC 患者5 年生存率僅在5%左右，臨床預后不佳［3］。目前，HCC 的具體發病機制仍不明確。因此，更好地了解病因和進展過程中的關鍵因素和調控途徑，對新的預后指標和治療靶點的預測以及HCC 患者臨床治療的改善具有重要意義。

脯氨酸在細胞增殖、凋亡及自噬中扮演重要角色［4］。PYCR1 能夠催化NADP 依賴的吡咯啉-5-羧酸轉化成脯氨酸，在脯氨酸的生物合成中發揮重要作用［5］。有研究［6］指出，人類PYCR1 基因突變可引起皮膚松弛癥。此外，PYCR1 基因在結腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中與腫瘤發生、發展、轉移及化療敏感性相關［7-10］。最近一項研究［11］報道指出，HCC 組織中PYCR1 mRNA 和蛋白水平均顯著高于癌旁組織。然而，HCC 患者中PYCR1 表達與臨床病理特征和預后的關系尚不清楚。本研究通過探討PYCR1 表達水平與患者臨床病理特征和預后的關系，為HCC 患者臨床治療靶點選擇提供循證醫學證據。

1 對象與方法

1.1 研究對象80例HCC患者病理標本均為中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院肝膽外科2015 年1 月至2018 年12 月收集，隨訪資料完整。本研究獲得醫學倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器總RNA提取試劑盒（DP419，TIANGEN，北京）；qRT-PCR 反轉錄試劑盒（FP314，TIANGEN，北京）；SYBR@Premix Ex TaqTMII 試劑盒（RR820A，TaKaRa，大連）；PYCR1 抗體和GAPDH抗體（ab102601/ab8245，Abcam，美國）；甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）檢測試劑盒（LT5020401，藍圖生物，黃石）；癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）檢測試劑盒（YKE-C14，研科生物，廣州）。

1.3 PYCR1 mRNA 表達水平測定利用總RNA提取試劑盒采用離心柱法提取HCC 及癌旁組織總RNA；A260/A280范圍為1.8 ～2.0，計算mRNA 濃度；將瓊脂糖變性凝膠電泳檢測完整性良好的RNA按照qRT-PCR 反轉錄試劑盒說明逆轉錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待用；以β-actin 為內參基因，PYCR1 引物序列為：上游5′-CGCCGACATTGAGGACAGAC-3′，下游5′-CGACTGGAGTGTTGGTCATGC-3′，根據SYBR@Premix Ex TaqTMII 試劑盒說明書進行熒光定量PCR 擴增反應。結果以2-△△Ct方法計算，實驗獨立重復3 次。

1.4 PYCR1 蛋白表達水平測定HCC 及癌旁組織蛋白采用蛋白裂解法收集；BCA 法檢測蛋白含量，確保各孔上樣量相等，進行垂直電泳，轉膜，TBS 漂洗，封閉液封閉2 h；加入兔抗人PYCR1 和GAPDH 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌后加人二抗，在室溫下30 min 后，再TBST 洗滌，暗室內發光顯影。

1.5 PYCR1免疫組織化學染色方法及分組HCC組織標本經10%甲醛固定，常規石蠟包埋，切片；60 ℃烘片，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，檸檬酸緩沖液高壓修復抗原，3%雙氧水封閉后滴加一抗與辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 二抗，染色并封片，其他按照試劑盒說明書操作。PYCR1表達量判定方法：由3 位病理學醫師采用雙盲法在顯微鏡下觀察組織切片上每個小塊的所有區域，判定染色強度和染色陽性率。染色強度評分：0 分（陰性）、1 分（陽性）、2 分（強陽性）。染色陽性率評分：0 分，1 分（1% ～25%），2 分（26% ～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。以染色強度評分和染色陽性率評分的乘積為總評分，＜4 分為PYCR1 低表達，≥4 分為PYCR1 高表達［12］。本研究中，PYCR1 低表達22 例，PYCR1 高表達58 例，見圖1。

圖1 PYCR1 在HCC 組織中的表達Fig.1 Expression of PYCR1 in HCC tissues

1.6 隨訪采用電話或患者來院就診的方式對所有患者進行隨訪，隨訪至患者死亡或2020 年9 月1 日。記錄兩組患者5 年無瘤生存時間和總體生存時間。隨訪時間13 ～63 個月，平均（48.02 ±12.35）個月。

1.7 統計學方法應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，比較采用t檢驗；計數資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗。采用Cox 比例風險模型對影響HCC 患者預后的因素進行單因素、多因素分析。采用Kaplan-Meier 法繪制HCC 患者生存曲線，并應用Log-rank法進行差異性檢驗。所有統計采用雙側概率檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PYCR1在HCC和癌旁組織中表達水平比較HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對表達量均明顯高于癌旁對照組（均P＜0.05）。見表1，圖2。

表1 PYCR1 在HCC 和癌旁組織中表達水平比較Tab.1 Expression of PYCR1 in HCC and adjacent tissues±s

表1 PYCR1 在HCC 和癌旁組織中表達水平比較Tab.1 Expression of PYCR1 in HCC and adjacent tissues±s

組別HCC 組癌旁對照組t 值P 值例數80 80 PYCR1 mRNA相對表達量2.26±0.48 0.84±0.22 24.054＜0.001 PYCR1 蛋白相對表達量1.45±0.31 0.59±0.17 21.756＜0.001

圖2 PYCR1 在HCC 和癌旁組織蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels of PYCR1 in HCC and paracancerous tissues

2.2 HCC組織中PYCR1表達水平與臨床病理特征的關系HCC組織中PYCR1表達水平與腫瘤大小、衛星灶、血管侵犯、TNM 分期有關（均P＜0.05），其余指標無相關性（均P＞0.05）。見表2。

表2 HCC 組織中PYCR1 表達水平與臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between expression level of PYCR1 and clinicopathological characteristics in HCC例（%）

2.3 影響HCC 患者預后的單因素、多因素Cox 回歸分析Cox 回歸分析結果顯示，腫瘤大小、衛星灶、血管侵犯、TNM 分期、PYCR1 表達水平是影響HCC患者5年總體生存率的獨立因素（均P＜0.05）；血管侵犯、TNM 分期、PYCR1 表達水平是影響HCC患者5 年無瘤生存率的獨立因素（均P＜0.05）。見表3、4。

表3 影響HCC 患者預后的單因素Cox 回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis of prognosis in patients with HCC

表4 影響HCC 患者預后的多因素Cox 回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis of prognosis in patients with HCC

2.4 HCC組織中PYCR1表達水平與預后的關系Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，HCC 組織中PYCR1 低表達組患者5 年總體生存率、無瘤生存率明顯高于PYCR1 高表達組（均P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖3 HCC 組織中PYCR1 表達水平與5 年總體生存率和無瘤生存率的關系Fig.3 Relationship between PYCR1 expression and 5 years overall survival rate and disease-free survival rate in HCC

據報道，50% ～90%接受HCC 根治切除術的患者最終都死于腫瘤復發［13］。因此，早期發現是提高HCC 患者生存率的有效策略之一。迄今為止，許多臨床病理特征和生物標志物被發現與HCC 患者預后顯著相關［14-15］。然而，對影響HCC預后因素的識別遠遠不足以使既往研究結果普遍應用于臨床。本研究選擇與腫瘤發生、發展、轉移及化療敏感性相關的PYCR1 基因，從mRNA、蛋白相對表達量方面入手，比較HCC 組織與癌旁組織中PYCR1 表達差異。通過免疫組織化學法，確定PYCR1 高表達和低表達組，分析PYCR1 表達水平與HCC 患者臨床病理特征和預后關系。本研究發現，HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對表達量均顯著高于癌旁對照組，組織中PYCR1 表達水平是影響HCC 患者5 年無瘤生存率和總體生存率的獨立因素，HCC 組織中PYCR1 低表達組患者5 年總體生存率、無瘤生存率高于PYCR1 高表達組。

有報道［16］指出，脯氨酸代謝過程中的兩個關鍵酶脯氨酸脫氫酶/脯氨酸氧化酶和PYCR1 與惡性腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移密切相關。PYCR1是廣泛存在于人體各種組織細胞中的一種線粒體酶，可將NAD（P）H+的氧化還原產物轉運至線粒體，在細胞中促進脯氨酸合成。有研究證實，PYCR1 是原癌基因c-myc 的靶點，發揮抗腫瘤細胞凋亡和抗氧化的作用［17］。DING 等［18］的研究指出，乳腺癌的形成與谷氨酸-脯氨酸代謝密切相關，PYCR1 在乳腺癌組織中高表達，其mRNA 水平與乳腺癌患者生存率呈負相關；此外，體外研究［18］證實，siRNA 干擾PYCR1 基因后，乳腺癌細胞的生長和侵襲能力受到抑制。FU 等［19］的研究指出，PYCR1 mRNA 和蛋白水平在腎癌組織中高表達，與TCGA 數據庫結果一致；PYCR1 蛋白水平檢測對腎癌的診斷具有一定的準確性；PYCR1 是腎癌患者預后的獨立預測因子。謝智彬等［20］通過探討PYCR1 在膀胱癌組織中的表達及其臨床意義，發現PYCR1 在膀胱癌中高表達，并與年齡、病理分級、N 分期、T 分期、M 分期和臨床分期密切相關，提示PYCR1 參與了膀胱癌的發生及進展。上述研究表明，PYCR1 或許可以作為腫瘤診斷和預后的一種新型標志物，并有望成為腫瘤治療的新靶點。PYCR1 與HCC 關系的研究報道不多，最近一項研究報道［11］，HCC 組織中PYCR1 mRNA 和蛋白水平均顯著高于癌旁組織，通過抑制HCC 細胞株BEL-7404 細胞和SMMC-7721 細胞中PYCR1 的表達之后，肝癌細胞的增殖能力受到顯著抑制，細胞凋亡率顯著升高，這一過程受到c-Jun 氨基末端激酶/胰島素受體底物1 信號通路調節；裸鼠實驗也證實了干擾PYCR1 表達可顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，瘤體的體積和重量顯著縮小。本研究與上述研究結果一致，結果顯示HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對表達量均顯著高于癌旁對照組。本研究還發現，組織中PYCR1 表達水平與腫瘤大小、衛星灶、血管侵犯、TNM 分期有關，提示PYCR1 發揮的潛在機制可能與大腫瘤（＞5 cm）患者的比例增加、形成腫瘤衛星灶、促進血管侵犯和TNM 分期進展有關。

本研究為單中心研究，樣本量較少，影響統計效能，還需大樣本、多中心研究加以驗證。總之，本研究發現PYCR1 基因在HCC 組織中高表達，并與HCC 患者臨床病理特征存在相關性，提示PYCR1 可能參與了HCC 的發生、發展。PYCR1 表達水平與HCC 患者預后關系密切，提示PYCR1 或許可作為一種新的預后指標和治療靶點。然而，PYCR1 與HCC 之間關系的確切機制目前尚未明確，后續研究還應建立過表達及沉默PYCR1 的HCC 細胞株模型，探討其參與HCC 發生、發展的可能機制。