不明原因智力低下和孤獨癥譜系障礙兒童脆性X綜合征的篩查結果分析

雷潔 龍敏 肖硯微 林曉文 張靜

(深圳市南山區婦幼保健院檢驗科，廣東 深圳 518067)

脆性X綜合征(FXS)是常見的遺傳性智力低下疾病之一[1]，也是引起孤獨癥譜系障礙最主要的單基因遺傳疾病[2]。超過99%的FXS是由于Xq27.3的脆性X智力低下基因1 (FMR1) 5’端非編碼區(CGG)n三核苷酸重復序列的異常擴增及CpG島的異常甲基化引起脆性X智力低下蛋白(FMRP)的表達下降或缺失所導致[3-4]，目前尚無有效的治療方法。因此，開展廣泛的篩查工作，對攜帶者和患者予以必要的遺傳咨詢和產前診斷以降低患兒的出生率是防治此病的關鍵。本研究中，我們對不明原因智力低下和孤獨癥譜系障礙兒童脆性X綜合征FMR1基因篩查情況及表型進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2019年11月就診于我院的不明原因智力低下和孤獨譜系障礙患兒35例。其中男31例，女4例；年齡1～10歲，平均4.7歲。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析 采用常規外周血淋巴細胞培養法，培養68～72 h，收獲前1 h用秋水仙素處理，制片，進行G顯帶核型分析，每例隨機計數30個分裂相，嵌合體病例計數100個分裂相。分析3～5個核型，異常者加倍計數與分析并根據人類細胞遺傳學國際命名體制命名(ISCN2016)。

1.2.2全基因組拷貝數變異檢測(CNV-seq) 收集脆性X綜合征篩查患者外周血，結合低通量測序基因組拷貝數分析(CNV-seq)和生物信息學分析技術，利用BGISEQ500測序平臺進行全基因組范圍內染色體拷貝數異常檢測。具體包括基因組DNA的提取、酶切、連接接頭、PCR富集、純化、獲得DNA文庫、測序和分析等步驟。將測序讀長與已知人類參考基因組進行匹配比對，統計完全匹配的讀長數，計算樣本間的Log2比值，并采用特定算法判讀待測樣本的染色體情況。針對大小為100 kb以上的片段進行致病性分析。CNVs的臨床意義參照最新版美國醫學遺傳學與基因組學會(ACMG)遺傳變異分類標準與指南[5]通過檢索DECIPHER、DGV、OMIM數據庫，并結合表型及CNV-seq比對結果綜合判定。

1.2.3脆性X綜合征篩查實驗 采集患者外周血2 mL，利用外周血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。采用閱微基因脆性X綜合征檢測試劑盒、PCR儀及基因分析儀(ABI 3500 DX Genetic Analyzer)，利用熒光定量PCR擴增結合毛細管電泳檢測法對FMR1基因5’端非編碼區CGG重復次數進行檢測。CGG重復數量小于45 次為正常型，45～54 次為中間型，55～200 次為前突變型，大于200次為全突變型。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床資料及結果 在35例患兒中，智力低下者14例，占40%；孤獨系譜障礙7例，占20%；另外還包括語言發育遲緩等臨床表型。35例患兒中31例外周血染色體核型正常，染色體多態性2例，另外2例染色體核型異常患兒分別為47,XY,+mar和46,XY,inv(8)(p11.2q21.2)。CNV分析結果顯示31例正常，4例異常患兒分別為del(20)(q13.13) chr20:g.49317261_49608453del，dup(18p11.1p11.32)chr18:g.67662_150410898×4，dup(22)(q11.23) chr22:g.23674079_25063169dup以及dup(16)(p13.3) chr16:g.59995_156550dup。脆性X基因篩查結果顯示，FMR1基因(CGG)n重復數小于40的有32例，占91.43%；(CGG)n重復數40～45之間的有2例，占5.71%；此外有1例患者FMR1基因(CGG)n重復數大于200，占2.86%。見表1。

表1 35例不明原因智力低下及孤獨系譜障礙患兒核型、CNVs及脆性X基因篩查結果分析

(續表) 表1

2.2脆性X綜合征陽性病例表型及家系分析 35例患兒中檢出1例患者的FMR1基因(CGG)n重復數大于200，患者男性，受檢時2歲10個月，臨床表現語言發育遲滯，只會叫“媽媽”，大耳，陰莖較同齡兒童大，另身高明顯高于同齡兒童。患兒母親表現為長臉，身高較高，余無明顯異常，父親無明顯異常表征，對患兒父母進行脆性X綜合征篩查發現其母親FMR1基因(CGG)n重復數為128，為前突變型，父親正常。同時，患兒的CNV測試未檢測出有臨床意義的染色體拷貝數異常。見圖1。

圖1 脆性X綜合征陽性病例的FMR1基因(CGG)n重復數和CNVs分析

3 討 論

脆性X綜合征是僅次于唐氏綜合征的引起智力低下的疾病[6]。由于X染色體連鎖遺傳特征，男性患病率約為1/7 000，明顯高于女性患病率1/11 000[7]。本研究中的篩查對象也以男性患者為主。同時，脆性X綜合征常表現孤獨癥樣的癥狀，如社會交往能力差、非言語及言語交流障礙以及重復的機械刻板行為，是孤獨癥譜系障礙最常見的共患病[8]。脆性X綜合征在不同人群中的患病率有所差異，在高加索男性智力低下人群中的發病率為2.6%～8.7%[9]，亞洲人群中臺灣地區發病率約為1.9%[10]，日本男性智力低下患者中脆性X綜合征的發生率約為0.8%～2.4%[11]。本研究中通過檢測發現1例患兒的FMR1基因(CGG)n重復數大于200，為全突變型，占2.86%，與前述研究發病率基本符合。而我國其它學者報道的脆性X綜合征在智力低下患兒中的發病率有較大差異，如N.Zhong等[12]在1 127例智力低下患者中發現脆性X綜合征的發病率為2.8%，與本研究相仿；李薇等[13]對2 300例智力低下患者篩查發現90例脆性X綜合征，占3.9%，略高于本研究；而趙蓓等[14]的研究則在3 844例智力低下患者中篩查發現了343例脆性X綜合征，占8.9%。由此可見，針對脆性X綜合征開展大規模的篩查工作，對于明確其在我國智力低下人群中準確的發病率具有重要意義。

針對脆性X綜合征的篩查主要依賴于臨床特征和實驗室檢查。臨床特征主要包括智力低下及相關家族史、大耳、巨睪癥、孤獨癥樣癥狀等[15]，本研究中發現的脆性X綜合征患兒呈現典型的語言發育滯后，智力低下，陰莖發育異常等臨床癥狀，對于臨床篩查具有重要的提示價值。然而，由于個體表型差異較大，表型復雜，且不易與其它導致智力低下和孤獨癥樣癥狀相區別。攜帶前突變基因的女性有50%的概率將突變傳遞給下一代，在子代中轉變成全突變的概率與母親前突變(CGG)n重復次數的大小有關，(CGG)n重復達100次以上時轉變成全突變的概率接近100%，該患兒母親FMR1基因(CGG)n重復數為128，再生育男孩患病風險接近100%。目前，脆性X綜合征FMR1基因的分子遺傳學檢測是確診的唯一手段，也是進行產前診斷的必備技術。CMA、CNV-seq等染色體拷貝數檢測技術和FMR1基因檢測已被推薦為不明原因智力低下遺傳學病因診斷的一線篩查手段[16]。值得關注的是，由于脆性X綜合征的檢測涉及FMR1基因非編碼區CGG重復數的檢測，目前常用分子遺傳方法如二代測序，CMA，CNV-seq等均不能檢出脆性X綜合征的動態突變。因此，針對FMR1基因動態突變的檢測是對不明原因智力低下及孤獨癥譜系障礙病因學分析重要的補充分析方法。依據FMR1基因突變的特點，現行已建立了多種有效的實驗室診斷方法，諸如Southern雜交、甲基化特異性PCR、免疫細胞化學方法等[17]。Southern雜交法是主要確診方法，但對CGG重復數較少的攜帶者或嵌合體可能漏診，酶解不完全時則可能誤診。而且該法費用昂貴，費時費力，需要大量DNA，有放射性危害，不適合基層大范圍篩查。常規PCR檢測可診斷正常和CGG重復數較少的攜帶者，但無法診斷CGG重復數較多的攜帶者和全突變者。本研究中采用的基于三引物熒光定量PCR結合毛細管電泳技術[18]，不僅具有靈敏度高、可重復性強的特征，更重要的是可準確計算出CGG重復數，并且對女性雜合子攜帶者具有良好的篩查效果(如本研究表1中篩查檢出2例女性患者的CGG重復數存在差異)，可快速準確區分不同基因型人群，對脆性X綜合征的篩查及確診實驗的開展具有良好的優勢。

綜上所述，針對智力低下、孤獨癥等人群開展脆性X綜合征的臨床和實驗室篩查工作對于提早發現、盡早干預，以及對患兒父母進行必要的遺傳咨詢和產前診斷，避免智力低下患兒的出生具有重要意義。