情志刺激加速小鼠動脈硬化進展與SDF-1/CXCR4失衡的相關性研究*

黃曾艷， 黃曼萍， 彭春麗， 劉永源， 李春燕， 梁東輝

（1南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515；2廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州510405；3南方醫科大學珠江醫院，廣東廣州510280；4茂名市人民醫院，廣東茂名525000）

易損動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊進展和破裂引起的血小板聚集和血栓形成是導致急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）等急性心腦血管事件的病理學基礎［1］。近年來，臨床就診的ACS 患者中精神心理問題突出，忽視對精神心理因素的干預可導致ACS 患者的治療依從性、臨床預后和生活質量顯著下降［2］。因此，重視精神心理問題并給予早期防治，有助于穩定AS 斑塊，防止ACS的發生和發展，減少發病率與病死率。

研究發現，基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）被認為是冠心病的易感基因［3］，血漿SDF-1 水平是預測心肌梗死病人發生死亡、再梗和心衰等事件的獨立危險因素［4］。CXC 趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）是目前研究較多的趨化因子，可特異性地結合SDF-1并互相形成生物信號關聯，廣泛參與AS 的發生發展過程。

本研究以SDF-1 和CXCR4 與情志刺激小鼠AS病變進展的相關性為出發點，通過慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）的方法干預載脂蛋白E 基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-）小鼠，從而復制ApoE-/-小鼠 CUMS情志刺激模型［5］，觀察AS斑塊組織病理學形態，同時檢測SDF-1和CXCR4在血漿、血小板、主動脈和海馬中的表達，觀察情志刺激與AS 斑塊易損性的相關性，為SDF-1/CXCR4 介導的動脈粥樣硬化病變下游信號通路的研究奠定基礎。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

從常州卡文斯實驗動物有限公司購進30 只雄性ApoE-/-小鼠和10 只具有相同遺傳背景的野生型C57BL/6J 小鼠，SPF 級，8 周齡，體質量為（22±1）g，動物許可證號為SCXK（蘇）2011-0003。

2 主要試劑及儀器

小鼠SDF-1 和CXCR4 ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；鼠抗SDF-1 多克隆抗體和鼠抗CXCR4 單克隆抗體（Abcam）；抗GAPDH 抗體（北京全式金生物技術有限公司）；聚合HRP 標記的IgG Ⅱ抗（武漢博士德生物科技有限公司）；DAB 顯色液（廣州賽國生物公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（廣州碧云天生物技術研究所）。RM2235 切片機（Leica）；TS100-F 型熒光倒置顯微鏡（Nikon）；MK3 酶標定量測定儀（Thermo）；SDS 電泳系統（北京君意東方電泳設備有限公司）。

3 方法

3.1 分組及造模 30 只8 周齡雄性ApoE-/-小鼠，造模前給予基礎飼料適應性喂養1 周后，按照數字表法隨機分為正常對照（normal control）組、高脂（high fat）組和CUMS 情志刺激模型組（CUMS 組），每組各10只，另取10只同周齡近交系C57BL/6J小鼠設為空白對照（blank control）組。小鼠飼養環境相同（飼養條件SPF 級，室溫22℃～24℃，相對濕度為50%，光照時段為7：00～19：00），自由飲水。空白對照組和正常對照組小鼠給予普通飼料喂養；高脂組小鼠全程給予含脂肪21%和膽固醇0.15%的西方膳食飼料（60Co γ 射線滅菌，北京科澳協力有限公司）喂養，無其他干預；CUMS 情志刺激模型組小鼠給予高脂飼料喂養的同時，加用CUMS 方法干預12周，從而復制ApoE-/-小鼠 CUMS 情志刺激模型［5］。實驗共進行13周。

3.2 CUMS情志刺激造模 本研究采用國際公認的CUMS 方法復制ApoE-/-小鼠情志刺激模型［5］，具體方法如下：（1）傾斜鼠籠：讓小鼠保持在傾斜45°的鼠籠6 h；（2）濕潤環境：用水將墊料弄濕（避免加水過多產生大水池），將小鼠放置在此潮濕環境6 h；（3）快速燈光交換+白噪音：將小鼠置于暗箱中，自動定時器每隔7 min 交換明暗燈光，同時結合白噪音（110 db）刺激小鼠，持續2 h；（4）整晚照明：小鼠從7：00 pm-7：00 am 被置于明亮燈光室過夜；（5）孤立后群居：每只小鼠單獨放置在一個籠子持續4 h 后，再將10 只小鼠共同放置在1 個籠子里持續2 h（觀察小鼠，如果發生斗毆則人為分開）；（6）禁食24 h；（7）禁水24 h；（8）夾尾：用重量約800 g的塑料夾夾在距離小鼠尾根1～1.5 cm 處（紗布包住尾巴以免夾傷造成組織傷害），持續15 min 后，將夾子取下。以上幾種CUMS 干預方法隨機安排，相同刺激不連續加入，使ApoE-/-小鼠不能預知次日的刺激，避免小鼠因適應刺激而影響干預結果。每日CUMS 刺激前后觀察各組ApoE-/-小鼠的一般狀況，重點記錄小鼠行為狀態，如行動活躍度、興奮程度、皮膚毛發、飲食、睡眠等內容。

3.3 檢測指標及方法 各組小鼠到達實驗時點后取材，取材前小鼠禁食禁水12 h，無菌條件下，依據每只小鼠體重使用1%戊巴比妥鈉不同劑量腹腔注射麻醉后：（1）經摘除眼球取血，選用洗滌法分離純化血漿、血小板；（2）無菌條件下解剖小鼠，迅速打開胸腔和腹腔，從主動脈弓處輕輕分離主動脈至髂動脈分支處；（3）無菌手術剪剝除顱骨，于四疊體中部向前傾斜30°剖開腦組織，取海馬區新鮮腦組織；（4）無菌條件下暴露并取出整條股骨、脛骨，Hanks液反復沖洗骨髓，收集骨髓細胞混懸液，離心棄上清后保存備用。

3.3.1 血漿SDF-1 和CXCR4 含量的檢測 嚴格依照ELISA 試劑盒說明書，進行標準品的稀釋、加樣、酶標板上蓋、覆膜、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止。終止反應15 min 內，選擇450 nm 波長，測量各孔的吸光度，依據標準品的吸光度創建相應的標準曲線，從而算出小鼠血漿SDF-1 和CXCR4的水平。

3.3.2 冷凍切片油紅O 染色觀察主動脈病理損傷程度 實驗末小鼠處死后，各組小鼠行主動脈冷凍切片油紅O 染色，具體步驟如下：（1）載玻片粘取冷凍切片，切片干燥后入60%異丙醇浸洗10 min；（2）油紅O 工作液染色10 min；（3）60%異丙醇分化3～10 s至間質清晰，水洗；（4）Mayer蘇木精復染1 min，自來水返藍；（5）濾紙吸干水分，甘油明膠封片。依據每個標本連續切片的染色結果，選擇AS 斑塊面積最大的切片做病理形態學分析。

3.3.3 免疫組織化學染色檢測主動脈內SDF-1 和CXCR4 的表達 實驗末小鼠處死后，各組小鼠主動脈行石蠟切片，烤片，脫蠟至水；3% H2O220 min；PBS 洗 3 min×3 次；0.05% 胰蛋白酶 37℃ 30 min；PBS 洗3 min×3 次；37℃封閉1 h；吸去封閉液，滴加Ⅰ抗（抗 SDF-1 抗體 1∶250 稀釋，抗 CXCR4 抗體 1∶500 稀釋），4℃過夜；37℃復溫1 h；PBS 洗3 min×3次；滴加聚合HRP 標記的抗小鼠IgG Ⅱ抗，室溫孵育1 h；PBS洗3 min×3次；DAB顯色；充分水洗；蘇木素染色1 min；水洗；分化數秒；氨水返藍10 min；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片；59℃烤箱過夜。

顯微鏡下觀察：陽性細胞為抗原呈顆粒狀、或彌漫性棕黃色或棕褐色著色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀分析小鼠主動脈陽性產物的積分吸光度（integrated absorbance，IA）及 血 管 總 面 積（sum area），IA/sum area 即為平均吸光度（mean absorbance，MA）。

3.3.4 Western blot 檢測ApoE-/-小鼠血小板、主動脈、海馬和骨髓中SDF-1 和CXCR4 的蛋白表達 各組小鼠分別提取主動脈、海馬組織蛋白，提取血小板、骨髓細胞蛋白，加入細胞裂解液，低溫機器勻漿混勻，10 000 r/min 離心 3 min，取上清，根據 BCA 蛋白定量試劑盒說明書測定樣品蛋白含量后制樣。分別按照各自計算的上樣量上樣，進行SDS-PAGE，行濕轉法蛋白轉膜，脫脂奶粉快速封閉30 min。特異性抗體按比例稀釋（抗 SDF-1 抗體1∶250 稀釋，抗CXCR4 抗體1∶500 稀釋），封口，4℃孵育過夜；HRP標記的Ⅱ抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h。經洗滌、顯影、灰度掃描后，用ImageJ 圖像分析軟件對電泳條帶進行測定，分別以目的條帶灰度與內參照GAPDH灰度的比值表示SDF-1和CXCR4蛋白的表達水平。

4 統計學處理

運用SPSS 19.0 軟件進行統計學處理。實驗數據用均數±標準差（mean±SD）表示。連續性變量指標組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析（oneway ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠行為的變化

ApoE-/-小鼠行為變化的記錄結果顯示，與其余組比較，情志刺激模型組ApoE-/-小鼠表現出行動活躍度、靈活性、興奮度減低，皮膚毛發光澤度減少，喜歡貼邊、瞇眼、嗜睡和覓食活動減少等行為學異常狀態。

2 ELISA法檢測小鼠血漿中SDF-1和CXCR4的表達水平

空白對照組血漿中SDF-1 和CXCR4 的水平最低，CUMS 情志刺激模型組最高；與空白對照組相比，正常對照組、高脂組和CUMS 情志刺激模型組SDF-1 和CXCR4 的含量顯著升高（P＜0.05）；與正常對照組比較，高脂組和CUMS 情志刺激模型組SDF-1和 CXCR4 的含量顯著升高（P＜0.05）；與高脂組相比，情志刺激模型組SDF-1 和CXCR4 的含量顯著升高（P＜0.05），見圖1。

3 小鼠主動脈的病理形態觀察

冷凍切片油紅O 染色通過檢測含脂泡沫細胞及其組成的粥樣斑塊判斷主動脈的粥樣硬化程度?？瞻讓φ战M小鼠的主動脈各層排列整齊，結構清晰，細胞形態良好，少見皺褶、空泡，無AS病灶，見圖2A；其余3 組小鼠的主動脈均存在不同程度的AS 病變，粥樣硬化區域脂質呈鮮紅色，細胞核呈藍色，間質無色；正常對照組處于脂紋期，AS 病灶可見少量泡沫細胞聚集于部分內膜下，見圖2B；高脂組和CUMS 情志刺激模型組以粥樣斑塊和復合斑塊為主要表現，細胞成分減少，脂質成分較豐富，大量泡沫細胞崩解，纖維及基質成分增加，斑塊深部為大量無定形壞死物質，為AS 最具特征性的病變，見圖2C、D；其中CUMS情志刺激組小鼠AS斑塊所占動脈管腔面積最大，呈現薄纖維帽、大壞死核、中膜裂隙和大量針狀空隙膽固醇結晶，脂質池較大，不穩定斑塊已發生破裂，見圖2D。

Figure 1.Plasma levels of SDF-1 and CXCR4 in the mice of different groups.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group；△P＜0.05 vs normal control group；▲P＜0.05 vs high fat group.圖1 各組小鼠血漿SDF-1和CXCR4水平的比較

Figure 2.Pathological changes of aortas in mice from different groups observed by oil red O staining（×200）.A：blank control group；B：normal control group；C：high fat group；D：CUMS group.圖2 各組小鼠主動脈病理學改變

4 免疫組化法檢測各組小鼠主動脈組織中SDF-1和CXCR4的蛋白表達

免疫組化結果顯示，SDF-1 和CXCR4 主要表達于小鼠主動脈平滑肌細胞和內皮細胞胞漿中。其中SDF-1陽性表達產物呈棕褐色顆粒，在空白對照組中表達微弱，接近陰性；在正常對照組中表達較少，著色淺，呈淺棕褐色；在高脂組和CUMS 情志刺激模型組中可見大量陽性表達顆粒，主要表達于AS 斑塊纖維帽的平滑肌細胞胞漿中，顏色呈深棕褐色，見圖3A。CXCR4 陽性表達產物呈棕黃色彌漫性著色，在空白對照組中表達較少，著色不連續，呈淺黃色；在正常對照組中表達較空白對照組強，著色連續，顏色較深；在高脂組和CUMS 情志刺激模型組中除血管及斑塊纖維帽的平滑肌細胞和內皮細胞中表達呈強陽性外，在斑塊內的泡沫細胞上也有表達，呈深棕黃色，見圖3B。

比較各組小鼠主動脈SDF-1和CXCR4陽性產物的MA值顯示：與空白對照組相比，正常對照組、高脂組和CUMS 情志刺激模型組SDF-1 和CXCR4 的表達顯著升高（P＜0.05）；與正常對照組比較，高脂組和CUMS 情志刺激模型組SDF-1 和CXCR4 的表達水平顯著升高（P＜0.05）；與高脂組相比，CUMS情志刺激模型組SDF-1 和CXCR4 的表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3C、D。

Figure 3.Detection of SDF-1 and CXCR4 expression in aortas of mice by immunohistochemical staining.A and B：the expression of SDF-1 and CXCR4 in aortas was detected by immunohistochemistry；C and D：the MA values of SDF-1 and CXCR4.a：black control group；b：normal control group；C：high fat group；d：CUMS group.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group（a）；△P＜0.05 vs normal control group（b）；▲P＜0.05 vs high fat group（c）.圖3 免疫組化法檢測各組小鼠主動脈SDF-1和CXCR4表達及MA值的比較

5 情志刺激對ApoE-/-小鼠血小板、主動脈、海馬和骨髓中SDF-1和CXCR4蛋白表達的影響

與空白對照組比，正常對照組、高脂組和CUMS情志刺激模型組小鼠血小板、主動脈和海馬SDF-1和CXCR4 蛋白表達顯著增高（P＜0.05），骨髓SDF-1和CXCR4 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與正常對照組比，高脂組和CUMS 情志刺激模型組小鼠血小板和主動脈和海馬SDF-1和CXCR4蛋白表達顯著增高（P＜0.05），骨髓SDF-1 和CXCR4 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與高脂組相比，CUMS 情志刺激模型組血小板、主動脈和海馬SDF-1 和CXCR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），骨髓SDF-1 和CXCR4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

討 論

目前，隨著“生物-心理-社會醫學”模式的發展，不良情緒如焦慮、抑郁等精神心理因素與ACS 的關系逐漸受到人們的重視?；趯CS 患者精神心理問題的長期觀察研究和臨床實踐，我們發現不良的情志刺激是ACS 發病的重要因素，給予ACS 患者常規基礎用藥的同時，重視精神心理治療和中醫疏肝理氣中藥的運用，對緩解ACS 患者的癥狀和穩定病情具有確切的療效［6-8］。本研究采用國際公認的CUMS應激方法，通過長時間、低強度的環境干擾、心理干預ApoE-/-小鼠，造成小鼠緊張、焦慮、抑郁等不良應激反應及異常的行為學狀態，從而有效地復制了ApoE-/-小鼠情志刺激模型［5］，且油紅 O 染色顯示CUMS組小鼠含脂泡沫細胞量高，主動脈發生了最嚴重的AS 病變，說明不良的情志刺激加速了小鼠動脈硬化進展。

Figure 4.The effects of emotional stimulation on SDF-1 and CXCR4 protein expression in the platelets，aortas，hippocampus and bone marrow of mice.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs blank control group；△P＜0.05 vs normal control group；▲P＜0.05 vs high fat group.圖4 SDF-1和CXCR4蛋白在小鼠血小板、主動脈、海馬及骨髓組織中的表達

SDF-1 又稱 CXCL12，屬于 CXC 類趨化因子亞家族成員，來源于骨髓微環境中的基質細胞，作為造血干/祖細胞、單核淋巴細胞、巨核細胞和嗜中性粒細胞的化學引誘物［9］，它不僅在炎癥及免疫監督方面發揮重要作用，同時也調節著血小板祖細胞間的相互作用，驅動血小板修復機制［10］。在超過100 000 例患者的全基因組關聯研究中發現，編碼序列位于10q11 的SDF-1基因被認為是冠心病的易感基因［3，11］，血漿 SDF-1 水平是預測心肌梗死病人發生死亡、再梗、心衰等事件的獨立危險因素［4］，與本研究中CUMS情志刺激小鼠骨髓SDF-1水平降低，血漿和血小板SDF-1水平升高結果一致。

CXCR4 屬于G 蛋白偶聯趨化因子受體，可與其配體SDF-1 特異性結合，從而激活下游的信號分子如聯絡黏附激酶、蛋白激酶C、細胞外信號調節激酶和核因子κB 等信號轉導通路［12］。大腦內源性的趨化因子系統，包括SDF-1/CXCR4，可作為大腦的第三大系統，與神經遞質和神經肽系統一起協同調節大腦功能［13］。海馬屬于邊緣系統重要結構之一，參與心理應激的神經內分泌和情緒調節，與抑郁等不良情緒的發生有因果關系［14］。作為AS 的始動環節，SDF-1 可上調CXCR4 表達，促進單核細胞黏附、聚集至內皮損傷部位，并進一步遷移入內膜下形成巨噬細胞，巨噬細胞又可攝取氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），形成在AS 發生過程中起關鍵作用的泡沫細胞；SDF-1/CXCR4 也可引起ox-LDL 介導的血管平滑肌細胞發生異常遷移與增殖，并抑制其凋亡，加速AS 的發生、發展，與本研究中CUMS 情志刺激干預的ApoE-/-小鼠主動脈和海馬中SDF-1和CXCR4水平升高的結果一致。

鑒于AS 病變與血漿、血小板、骨髓和海馬中SDF-1/CXCR4 表達的相關性，本研究對ApoE-/-小鼠采取CUMS結合高脂飲食喂養建立AS易損斑塊動物模型，以SDF-1/CXCR4的變化為主要觀察靶點，研究表明情志刺激狀態下，CUMS 小鼠血漿、血小板、主動脈和海馬中SDF-1 和CXCR4 的水平增加，骨髓中SDF-1 和CXCR4 的水平降低，與冷凍切片油紅O 染色顯示CUMS 小鼠主動脈粥樣硬化程度最重的病理結果一致，由此可見CUMS 情志刺激引起了SDF-1/CXCR4 表達失衡，并且加速了AS 進展，也進一步證實了情志刺激是引起AS 斑塊不穩定和破裂的重要因素之一。