Wnt1和LGR5在顱腦創傷后應激性潰瘍大鼠胃黏膜中的表達變化*

周小嬪， 王衍廷， 劉 斌△

（1武警特色醫學中心感染科，天津300162；2解放軍聯勤保障部隊960醫院神經外科，山東濟南250000）

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）可由于其神經系統功能改變引起應激性潰瘍（stress ulcer），臨床稱為庫欣潰瘍（Cushing ulcer）［1］，其發生與TBI 的嚴重程度密切相關，即病情越重，其發生率越高。對于應激性潰瘍的發生機制目前存在多種解釋，其中主要有神經內分泌失調、胃黏膜保護功能損傷及胃黏膜損傷因子作用增強［2］，對應激性潰瘍分子機制的闡釋也有研究［3］。Wnt 信號通路的上游啟動子Wnt1 及中心因子富含亮氨酸重復序列的G 蛋白偶聯受體5（leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，LGR5）與人體多種腫瘤發生密切相關，包括胃癌、肝癌、基底細胞癌、卵巢癌和食管癌等［4-7］。近年來發現這一信號通路也參與介導胃粘膜炎癥性改變，導致攻擊因子和/或防御因子失衡，進而誘發應激性潰瘍［8］。本實驗研究觀察了Wnt1 和LGR5 在顱腦創傷后應激性潰瘍大鼠胃粘膜中表達變化，進而探討其與顱腦創傷后應激性潰瘍的相關性，為臨床闡釋應激性潰瘍發生機制及應激性潰瘍的靶向治療提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

免疫組化試劑盒（北京中衫金橋）；抗β-actin 抗體（Absmart）；抗LGR5抗體（Epitomics）；Ⅱ抗（KPL）；Trizol 試劑（Invitrogen）。電子皮質損傷撞擊儀（electronic cortical contusion impactor，eCCI）和多普勒激光流量計（PF-5000，瑞典帕瑞醫學公司）。

2 方法

2.1 實驗動物及分組 SPF 級雄性7 周齡SD 大鼠30 只由解放軍軍事醫學科學院動物實驗中心提供，許可證號為SCXK（軍）2007-004，體重（300±15）g。將大鼠編號、稱重，隨機分為3 組，即假手術（sham）組、輕度TBI（mild TBI，mTBI）組和重度TBI（severe TBI，sTBI）組，每組10只。

2.2 模型復制 （1）將sham 組大鼠用5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔麻醉后固定于立體定向儀，頭部備皮消毒，手術刀片沿正中切開頭皮，剝脫分離骨膜，以牙科鉆在冠狀縫后5 mm、矢狀縫右側5 mm 交匯處，擴大骨窗至5 mm×5 mm，保持硬膜完整。（2）mTBI組大鼠重復上述操作，待夾尾反射出現后，將其固定于eCCI：設置打擊深度2 mm，持續時間120 ms，打擊速率3 m/s，打擊 1 次。（3）sTBI 組大鼠待夾尾反射出現后，將其固定于eCCI儀：設置打擊深度4 mm，持續時間120 ms，打擊速率4 m/s，打擊1次。

2.3 神經功能缺損評分（neurological severity score，NSS） eCCI 打擊后待動物完全蘇醒，由不了解實驗分組情況、經過專業培訓的研究人員分別在24和48 h兩個時點參照 Wang 等［9］的 NSS 表，應用盲法對大鼠進行評分。大鼠出現平衡障礙、向輕癱側傾倒、抱緊平衡木肢體從平衡木垂落可認為是mTBI；sTBI在以上癥狀體征出現同時伴有耳廓反射、角膜反射和驚恐反射消失，甚至可以出現肌陣攣和肌張力障礙。

2.4 胃黏膜大體結構觀察及HE 染色 造模后48 h，將大鼠處死，應用多聚甲醛灌流固定后，正中線開腹，游離胃組織，取胃組織沿胃大彎處剖開，生理鹽水沖洗胃組織內壁殘留物，直接肉眼觀察胃黏膜皺襞情況。另取胃組織石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規脫蠟，流水沖洗10 min 后，蘇木素染色2 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復染2 min，流水沖洗10 min，乙醇脫水，二甲苯兩次透明，中性樹膠封固。每張切片在100 倍顯微鏡視野下對胃黏膜進行觀察。

2.5 Western blot 實驗 eCCI 打擊后 48 h 取材，選取大鼠胃黏膜3 個部位（胃大彎處、賁門部和幽門部），按100 g 組織樣本加入100 μL 2× SDS 緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，1%SDS，50%glycerol，pH 6.8）的比例裂解樣本，研磨后于冰上裂解10 min，12 000 r/min（離心半徑8 cm）離心20 min，取上清液-80℃備用。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，取 50 μg 蛋白樣品，經SDS-PAGE 分離后轉至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉2 h，分別加入抗Wnt1 和LGR5 的Ⅰ抗，4℃過夜，洗膜后加Ⅱ抗，37℃孵育2 h。使用ECL 液顯色，最后進行顯影、定影，用Bio-Rad 凝膠成像系統掃描吸光度值，用Image-Pro Plus 6.0 軟件進行分析。定量結果應用GraphPad Prism 6.0統計作圖軟件繪制。

2.6 免疫組織化學染色 造模48 h 后，應用兔超敏二步法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司）進行免疫組化染色：大鼠胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min 后，pH 6.0 的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min 以修復抗原；冷卻至室溫后用5%的山羊血清室溫封閉20 min；滴加抗LGR5 的Ⅰ抗（1∶150），4℃過夜；PBS 清洗后依次滴加試劑1 和2，室溫孵育20min；DAB 顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復染，用乙醇脫水，再用二甲苯透明，最后中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽性反應物的分布與定位。隨機選取5 個不重復的視野，鏡下計數形態完整的LGR5陽性細胞，計算各組陽性細胞平均數。

2.7 大鼠胃組織血流量的多普勒監測 致傷48 h后，各組取5 只大鼠，水合氯醛溶液腹腔麻醉后，行多普勒超聲監測胃粘膜表面血流量，正中線剖腹，游離胃組織，插入激光血流儀探頭，分別置于胃底部、胃大彎、賁門部和幽門部4 處測定胃黏膜表面血流量。各部位記錄時間均為30 min，取平均值，單位為mL/（min×100 g）。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 6.0 統計作圖軟件進行分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較行單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 神經功能缺損評分的結果

如圖1所示，sham組未傷及正常腦組織，神經功能未缺損，評分正常；mTBI 組及sTBI 組神經功能出現明顯受損，主要表現為無法沿直線行走，平衡功能明顯障礙，外周感知能力下降，NSS 均顯著升高（P＜0.01），且sTBI 組較mTBI 組進一步升高（P＜0.01），提示sTBI 組大鼠神經功能損傷更重，即腦損傷程度更重。

Figure 1.NSS scores of the rats.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.圖1 大鼠NSS評分

2 胃黏膜大體觀察及胃黏膜HE染色結果

如圖2所示，sham組可見胃黏膜呈淡紅色，表面光滑，黏膜皺襞平整，黏膜上皮完整度好；mTBI組及sTBI 組均有不同程度胃黏膜組織損傷，表現為黏膜表面有血痂，部分胃黏膜表面可見散在不規則點狀出血灶，sTBI 組還可見黏膜水腫及片狀出血灶，部分黏膜可見皺襞變淺甚至消失。在光鏡下可見sham組大鼠胃組織結構正常，黏膜表面完整，未見炎癥細胞浸潤滲出；mTBI組及sTBI組大鼠可見部分黏膜上皮萎縮，正常腺體結構出現萎縮，部分可見紅細胞滲出，黏膜下層有炎癥細胞浸潤現象。

3 Wnt1和LGR5蛋白水平的變化

Western blot 結果顯示，mTBI 組及 sTBI 組大鼠胃大彎、賁門和幽門處胃黏膜中Wnt1 和LGR5 蛋白表達水平較sham 組均顯著升高（P＜0.05），且sTBI組Wnt1 和LGR5 蛋白表達水平較mTBI 組升高更明顯（P＜0.01），見圖3。

4 LGR5免疫組化染色結果

如圖4 所示，LGR5 免疫陽性產物主要定位于胞漿中，sham 組免疫陽性產物也有表達但表達量較低（76±5），mTBI 組及sTBI 組的免疫陽性產物表達量均顯著增多（P＜0.05），且sTBI 組（236±11）較mTBI組（178±11）顯著增多（P＜0.05）。

Figure 2.The structure of gastric tissue and pathological changes of gastric body in each group（HE staining，×100）.Images g，h and I were the local enlarged views of d，c and f，respectively.圖2 各組大鼠胃組織大體結構及胃組織胃體部病理變化

Figure 3.The protein expression of LGR5 and Wnt1 in gastric mucosa（great curvature，cardia and pylorus）of the rats detected by Western blot.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.圖3 大鼠胃黏膜三個部位（胃大彎、賁門和幽門）胃組織LGR5和Wnt1

Figure 4.Immunohistochemical staining of LGR5 in the rat gastric mucosa tissues（×200）.Images a，b and c were the local enlarged views of A，B and C，respectively.LGR5 immunopositive products were mainly localized in cytoplasm.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs mTBI group.圖4 大鼠胃黏膜組織LGR5免疫組織化學染色

5 胃黏膜多普勒超聲血流量檢測結果

如圖5所示，sham組與2個TBI組胃大彎處血流量基本保持同一水平，而2個TBI組賁門部近胃小彎處黏膜血流量較sham組顯著下降（P＜0.05），sTBI組血流量均值較mTBI 組下降更為明顯（P＜0.05）。這一結果提示TBI 確實改變了胃黏膜組織的血流，降低了局部胃黏膜的血流量。

Figure 5.The measurement results of gastric mucosal blood flow by Doppler ultrasound.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs mTBI group.圖5 多普勒超聲檢測胃黏膜血流量的結果

討 論

近年來的研究表明，有關TBI 的實驗多采用電子皮質損傷撞擊儀造模，均報道了TBI 模型未見死亡［9］，造模成功后，大鼠胃組織大體觀察及胃黏膜上皮HE染色可見，傷后大鼠胃組織宏觀與鏡下觀察的確出現了胃黏膜的點狀、片狀出血灶，局部胃黏膜炎癥細胞浸潤［10］，紅細胞滲出，腺細胞萎縮甚至消失，上皮細胞連續性中斷，損傷深達黏膜下層組織，這印證了創傷后應激性潰瘍發生的客觀性，這種病變的機制可能是通過上調了Wnt1 及LGR5 的表達實現的，在TBI干預后，蛋白水平Western blot 證實大鼠胃黏膜中Wnt1及LGR5蛋白的表達上升，LGR5的免疫組化實驗在細胞水平證實TBI 后LGR5 的異常高表達，且隨著 TBI 嚴重程度增加，Wnt1 及 LGR5 的表達均出現上升趨勢，證實了Wnt 信號通路相關蛋白高表達確實與TBI 的干預相關。本研究中mTBI 組及sTBI 組的胃黏膜血流量較Sham 組明顯降低，這可能與TBI 干預后的血液再分布有關。近年來研究認為，胃黏膜血流量下降在應激性潰瘍的發生中起主導作用［11］。局部胃黏膜的血流量充足是其保護性重要機制，TBI后使得黏膜血流量下降反過來又會導致黏液屏障完整性下降，從而加重潰瘍病的出現，從實驗中還可發現，這種局部血流量保護屏障作用損傷會隨著TBI 程度加重而加重，既是創傷后應激性潰瘍發生的原因又是結果。

以往大量的研究證實，Wnt 信號通路在腫瘤的形成和發展中起到重要調節作用［12］，例如各種消化道腫瘤，基底細胞癌，卵巢癌發生機制過程中都有Wnt 信號通路的作用。Wnt基因其實是一大基因家族，其中的Wnt1 在整個Wnt 信號通路中扮演啟動子角色［13］。經典的Wnt信號通路轉導途徑主要以Wnt/β-cantenin 途徑為主，其過程主要通過β-cantenin 向細胞核移位，激活TCF 轉錄活性，調節靶基因表達水平，這一重要靶基因即本研究中LGR5。LGR5 是具有18個富含亮氨酸的重復單位和7個跨膜區域組成的大分子蛋白，LGR5在人體多個組織結構中均有表達［14］，其作為Wnt 信號通路關鍵中心蛋白，在腫瘤研究領域備受關注，其異常表達或激活與腫瘤發生發展密切相關［15-16］。Sen 等［14］和 Polzer 等［17］的研究證實Wnt 信號通路介導了消化道黏膜損害過程以及參與一些慢性炎癥疾病，如風濕樣關節炎和動脈粥樣硬化。激活的Wnt 聯合下游靶基因LGR5介導了正常消化道黏膜組織修復、愈合和再生，很大程度上這一信號通路高表達會加重炎癥反應，可能在消化道黏膜炎癥進一步向消化道潰瘍轉化方面扮演重要角色［18］。這為創傷后消化性潰瘍的發生機制提供了新的解釋。

綜上所述，本研究成功應用eCCI 建立了大鼠TBI后應激性潰瘍模型，與國內外類似研究比較具有一定創新和先進之處。通過對Wnt信號通路中Wnt1及LGR5 在TBI 后出現高表達的研究，為顱腦創傷后應激性潰瘍的發生機制提供理論依據，也為研究治療TBI 后應激性潰瘍的新型藥物靶點研究提供實驗依據。另外，本實驗只研究了Wnt1 及LGR5 兩個重要蛋白表達變化情況，對于Wnt1 及LGR5 所在Wnt通路的上下游因子相互作用的關系，還有待進一步研究探討。