消腫止痛合劑對大鼠隨意皮瓣血管再生的影響*

劉 濤， 姚興璋， 何志軍△， 宋 淵 ， 李 巖， 李金鵬，陳 文， 王海剛， 何元旭

（1甘肅省中醫院，2甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730050）

皮瓣是重大創傷和整形外科重要的修復手段，然而皮瓣壞死屢見不鮮，因此盡快建立血液循環是皮瓣成活的關鍵。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-Dll4/Notch 信號通路在血管再生中發揮著重要作用，近年被研究者重視。中醫藥在這方面的取得了一定的研究進展。前期研究發現，消腫止痛合劑能促進鼠尾再植后的血管修復，提高VEGF 表達水平［1］。臨床研究發現消腫止痛合劑可顯著降低軟組織中腫瘤壞死因子α 和白細胞介素6的水平，促進皮瓣成活，降低轉化生長因子β1和單核細胞趨化蛋白1 等炎癥因子水平，阻止外傷后炎癥介質的釋放［2-3］。目前針對中醫藥通過VEGFDll4/Notch 信號通路調控皮瓣還鮮見報道。本研究采用大鼠隨意皮瓣模型，利用消腫止痛合劑及聯合VEGF-Dll4/Notch 信號通路阻斷劑干預，觀察皮瓣邊緣血管數量，將進一步揭示VEGF-Dll4/Notch 信號通路在皮瓣血管再生中的作用機制。

材 料 和 方 法

1 材料

240 只健康SD 大鼠購自甘肅中醫藥大學動物實驗中心，許可證號為SYXK（甘）2016-0012。VEGF 受體（VEGF receptor，VEGFR）抑制劑axitinib（AXI）和Notch 阻斷劑MK-0752 均購自Selleck；免疫組織化學染色II 抗試劑盒（BOSTER）。倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將240 只大鼠隨機分為6 組，空白（blank）組、假手術（sham）組、模型（model）組、消腫止痛合劑組（消腫組，detumescence 組）、消腫止痛合劑+AXI 組（detumescence+AXI 組）和消腫止痛合劑+MK-0752 組（detumescence+MK 組），每組 40 只。各組再按 4 個不同時點分為 5 d、10 d、15 d 和 20 d 亞組，每個亞組10只。

2.2 動物模型的建立 除空白組外所有SD 大鼠禁食6～8 h。術前行水合三氯乙醛（3 mg/kg）腹腔麻醉，麻醉生效后，行俯臥位固定。于背部形成2 cm×8 cm蒂部位于雙側髂棘連線上的隨意皮瓣，皮瓣內包括背部肉膜層，解剖應在背部肌膜的淺面進行。結扎創面較活躍出血點，以確保所形成皮瓣為隨意型皮瓣。皮瓣形成后用1 號縫合線間斷原位縫合。待大鼠麻醉完全恢復后送回飼養籠、觀察，單籠飼養。術后每日早上肌注青霉素12×104U，連用3 d。

2.3 藥物處理 消腫止痛合劑由甘肅省中醫院科研制劑中心制成，注冊文號為甘衛普制準字（1997）-202-04，批號為20051122，規格為每瓶250 mL。消腫組每日灌胃服用10 mL/kg 消腫止痛合劑（含生藥90 g/L）；消腫+AXI 組每日灌胃服用 10 mL/kg 消腫止痛合劑和 0.03 g/kg 的 VEGFR 抑制劑 AXI；消腫+MK 組每日灌胃服用10 mL/kg消腫止痛合劑和0.03 g/kg的Notch 阻斷劑MK-0752；模型組、空白組和假手術組每日灌服相應體積的蒸餾水。分別服藥5、10、15 和20 d 后分批麻醉并處死大鼠，剝離皮瓣組織多聚甲醛固定或-80℃保存，心臟取血離心分離血清。

2.4 HE 染色 皮瓣組織經多聚甲醛固定48 h 后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后進行石蠟包埋并切片。將脫水后的切片進行脫蠟至水，蘇木素侵染5 min，流水沖洗5 min 后，鹽酸分化5 s，伊紅染液侵染5 min，流水沖洗5 min 后，樹脂封片并進行拍照。利用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算皮瓣邊緣新生毛細血管的數量（每個高倍鏡視野下的陽性數目）、微血管密度（高倍鏡視野單位面積下微血管數目）、微血管管徑及血管成活面積。

2.5 ELISA 檢測血清中VEGF 的含量 根據說明書運用酶標儀得出相關吸光度（A），再根據公式計算VEGF含量。

2.6 RT-qPCR 檢測方法 將-80℃保存的皮瓣組織加入液氮研磨，呈粉末狀后，加入1 mL Trizol 裂解液，將細胞置于冰板裂解5 min 后，將裂解液轉移至離心管中-80℃保存。待所有樣品收集完畢后，Trizol 提取RNA，逆轉錄合成cDNA。按照TaKaRa Prime Ex TaqTMⅡPCR 試劑盒操作說明進行。加樣體積按照說明書進行，PCR 條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火，40 個循環，每個循環31 s，最后進行溶解階段。所有結果經GAPDH 內參照校正后，ΔΔCt 法計算最終結果并采用 2-ΔΔCt表示，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊者兩組間的差異比較用SNK-q檢驗，方差不齊者兩組間的差異比較用Dunnett 法。以P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

結 果

1 皮瓣毛細血管充盈時間

第5 天，模型組、消腫組、消腫+MK 組和消腫+AXI 組較空白組和假手術組毛細血管充盈時間均顯著延長（P＜0.05）；第10 天，與模型組相比，消腫組毛細血管充盈時間顯著縮短（P＜0.05），而與消腫組相比，消腫+AXI 組的毛細血管充盈時間顯著延長（P＜0.05）；第15 和20 天所有組間的差異均無統計學顯著性，見圖1。

Figure 1.The results of capillary filling time.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs blank or sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖1 毛細血管充盈時間結果

2 HE染色的觀察結果

假手術組大鼠皮瓣組織細胞呈單層，排列有序、細胞核清晰；模型組大鼠皮瓣組織細胞排列紊亂，細胞核稀疏，可見明顯水腫，大量白細胞浸潤；消腫組和消腫+MK 組大鼠皮瓣水腫明顯減輕，組織間隙炎癥細胞浸潤減少，見圖2～5。

3 藥物處理后微血管數量、大血管數量、微血管密度、微血管內徑和微血管面積的變化

第5、10、15 和20 天時，與假手術組比較，模型組微血管數量、密度和面積均顯著增加，其中第10 天增加最明顯（P＜0.05）；與模型組比較，消腫組微血管數量、密度和面積增加，其中第10 天增加最明顯（P＜0.05）；與消腫組相比，消腫+AXI 組的微血管數量、密度和面積顯著減少（P＜0.05）；與消腫組相比，第5天和10 天消腫+MK 組的微血管數量和密度顯著增加（P＜0.05）；第5、10、15 和20 天大血管數量和微血管內徑在所有組間的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見圖6～10。

Figure 2 HE staining results after 5 d of drug treatment（×100）.圖2 藥物處理5 d的HE染色結果

Figure 3.HE staining results after 10 d of drug treatment（×100）.圖3 藥物處理10 d的HE染色結果

4 血清中VEGF含量的檢測結果

第5 天時，模型組VEGF 含量較假手術組顯著增加（P＜0.05）；當加入消腫止痛合劑后，與模型組相比VEGF 含量顯著增加（P＜0.05）；然而加入VEGFR 抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF 增加消失，與消腫組相比，消腫+AXI 組VEGF 含量顯著降低（P＜0.05）；加入Notch 阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGF增加趨勢進一步增加，然而消腫組與消腫+MK組之間并無顯著差異。第10、15 和20 天的結果與第5天類似。見圖11。

5 皮瓣中 VEGFA、Notch 和 Dll4 mRNA 表達水平的檢測結果

第 10 天 時 ，模 型 組 VEGFA、Notch 和 Dll4 的mRNA 表達量顯著增加，與假手術組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；當利用消腫止痛合劑處理后，VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達量進一步增加，與模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；然而，當加入VEGFR 抑制劑后，消腫止痛合劑引起的VEGFA、Notch和Dll4的mRNA 表達量增加的趨勢被顯著抑制，與消腫組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；當加入Notch 阻斷劑后，消腫止痛合劑引起的VEGFA mRNA 表達量增加的趨勢更加明顯，而Notch 和Dll4 mRNA 表達量增加的趨勢被有效抑制（P＜0.05），見圖12。第 15 天時 VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達量與第10天類似，見圖13。

Figure 4.HE staining results after 15 d of drug treatment（×100）.圖4 藥物處理15 d 的HE染色結果

Figure 5.HE staining results after 20 d of drug treatment（×100）.圖5 藥物處理20 d的HE染色結果

討 論

皮瓣技術是顯微外科和矯形外科手術中重要的技術之一，用于覆蓋腫瘤切除后大的創口、覆蓋開放性傷口、治療骨髓炎及整形［4-6］。但困擾醫生的是發生術后皮瓣壞死，有研究報道皮瓣壞死發生率為10%～15%［7］。隨意皮瓣受長寬比例限制，一般不超過2∶1，這就極大地限制了其臨床應用。臨床總結認為，血運障礙為皮瓣壞死最主要的原因。因此，尋找更好的藥物和方法，改善皮瓣血運狀況［8］，盡快促進皮瓣血管再生是提高皮瓣成活率的重中之重。

瘀血或血瘀證是皮瓣修復術后并發血管危象的主要病理基礎，活血化瘀法應用于皮瓣修復術后體現了中醫辨病辨證施治的原則［9］。“活血”即活其血脈，改善和促進循環生理功能；“化瘀”即祛其瘀滯，緩解血凝狀態，解除已經發生的病理狀態。消腫止痛合劑為甘肅省中醫院院內制劑，由川芎、桃仁、紅花、赤芍、生地、當歸、三七、木香、青皮、澤蘭等組成，具有活血化瘀、消腫止痛之功。組方中的川芍、紅花、赤芍、三七等藥物均有單體實驗研究證明對血管有保護作用并具有抗凝作用；有研究證明川芎提取物川芎嗪可擴張血管，增加冠脈血流及腦血流，抑制血小板聚集，降低血小板活性，為一種鈣拮抗劑［10-11］。

血管再生是指原有的血管內皮細胞增殖、游走，形成新的血管網，并在原來存在的血管結構上長出新血管的生物學過程。VEGF 是目前發現最強的促血管再生的細胞因子，具有促血管內皮細胞增殖和遷移、促血管生成、延長血管內皮細胞壽命、提高血管通透性等生物學作用［12-13］。VEGF-Dll4/Notch 信號通路對血管再生調節的具體機制為：VEGFA 通過與VEGFR2 結合，刺激并誘導內皮頂端細胞表達Dll4，Dll4 與鄰近柄細胞內的Notch 信號結合，通過下調VEGFR2 和VEGFR1 的表達水平，抑制頂端細胞表型，促進柄細胞特化，使二者之間保持在一個合適的比例，以確保血管出芽的精確性［14］。由此可見，VEGF 是 Dll4 的正向調節因素，而 Dll4 是 VEGF 信號的負向調節因素［15］。VEGF-Dll4/Notch 信號通路在腫瘤血管再生及抗腫瘤藥物治療方面的研究較多，但是在皮瓣血管再生方面卻未見報道。

Figure 6.Changes in the number of microvessels.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖6 微血管數量的變化

Figure 7.Changes in the number of large blood vessels.Mean±SD. n=6.圖7 大血管數量的變化

Figure 8.Changes of microvascular density.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖8 微血管密度的變化

Figure 9.Changes of microvascular diameter.Mean±SD. n=6.圖9 微血管的內徑的變化

Figure 10.Changes of microvascular area.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖10 微血管的面積的變化

Figure 11.Determination of VEGF in rat serum.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖11 大鼠血清中VEGF含量的檢測結果

Figure 12.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 10 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖12 藥物處理10 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達檢測結果

Figure 13.The mRNA expression of VEGFA，Notch and Dll4 in flap tissues after 15 d of drug treatment.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs detumescence group.圖13 藥物處理15 d后皮瓣組織中VEGFA、Notch和Dll4的mRNA表達檢測結果

本研究著重研究消腫止痛合劑對VEGF-Dll4/Notch 信號激活與血管新生的作用。皮瓣由于缺血缺氧的發生會導致血管內皮細胞的凋亡，造成不可逆的損傷，所以臨床治療中需要促進血管的新生，保護血管內皮細胞完整。本研究發現，消腫止痛合劑可顯著提高皮瓣成活率，HE染色顯示該藥可增加微血管數量、密度和面積，減輕炎癥反應，增強VEGF的表達。由于VEGF 是促進血管形成的起始關鍵細胞因子，可激活Notch 和Dll4 信號，這樣的作用無疑是血管形成的關鍵。VEGFR 抑制劑可抑制VEGFA、Notch 和 Dll4 的 mRNA 表達增加，Notch 信號阻斷劑引起對 Notch 和 Dll4 mRNA 的抑制，而 VEGFA 的mRNA 表達繼續增加。抑制Dll4/Notch 信號轉導可通過促進新生血管和血管生成，提高皮瓣成活率。

綜上所述，消腫止痛合劑可以通過調控VEGFDll4/Notch 信號，促進大鼠皮瓣微血管數量、密度和面積增加，減輕皮瓣水腫，減少炎癥細胞浸潤，進而促進皮瓣的成活。本研究為消腫止痛合劑在皮瓣缺血缺氧治療方面的應用提供了初步的研究基礎。