母代高脂飲食對雄性后代小鼠青春期后期運動能力及學習記憶行為的影響*

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（青海省婦女兒童醫(yī)院，青海西寧810007）

在過去的幾十年里，肥胖發(fā)生率在世界范圍內(nèi)急劇上升，甚至已經(jīng)達到流行病的程度［1］。肥胖是多種代謝性疾病的根源，現(xiàn)在的研究表明，肥胖和營養(yǎng)不良，心血管疾病，糖尿病具有顯著相關性［2］。近些年，營養(yǎng)過剩導致的肥胖已取代營養(yǎng)不良成為我國主要的營養(yǎng)健康問題［3］。高脂肪高能量飲食結(jié)構(gòu)可提高肥胖和代謝性疾病發(fā)生率，同時女性圍產(chǎn)期肥胖或高脂飲食攝入可增加子代肥胖和代謝紊亂發(fā)生的風險［4］。胎兒暴露于高血脂水平的子宮環(huán)境中可引起自身大腦發(fā)育和代謝功能的重要改變［5］，女性圍產(chǎn)期肥胖對子代運動能力和學習記憶行為的損傷機制研究并不十分充分。

本實驗主要通過高脂飲食（high-fat diet，HFD）喂養(yǎng)母鼠16 周建立母鼠肥胖模型，通過轉(zhuǎn)棒實驗，曠場實驗研究了雄性子代小鼠運動能力的變化，通過水迷宮、新物體識別等實驗研究了子代小鼠學習記憶行為的改變，最后我們通過免疫熒光實驗觀察了子代小鼠海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）神經(jīng)元的分化和結(jié)構(gòu)變化。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF 級 C57BL/6J 母鼠 24 只和雄鼠 8 只購自南京模式生物，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0002，動物質(zhì)量合格證號為No.0016432。所有小鼠飼養(yǎng)在SPF 級動物房中，可自由進食進水，動物房室溫（22±1）℃，晝夜循環(huán)12 h。母鼠被隨機分為標準（脂肪含量為15%）飲食組（control 組）和高脂（脂肪含量58%）飲食組（HFD 組）。母鼠高脂飲食或標準喂養(yǎng)16 周建立肥胖模型，隨后每3 只母鼠與1只雄性同籠交配，雄性小鼠斷奶后與母鼠分離并正常飲食飼養(yǎng)至5 周齡進行相關動物學實驗，每組13只。本研究中所有動物實驗均通過青海省婦女兒童醫(yī)院倫理委員會審查并遵從動物福利3R原則。

2 主要試劑與儀器信息

BrdU、鼠抗DCX 抗體和鼠抗BrdU 抗體（Sigma）；熒光Ⅱ抗（Thermo Fisher）。主要儀器包括轉(zhuǎn)棒測試儀、曠場實驗、水迷宮測試裝置。曠場實驗及水迷宮測試所用設備為實驗室自制；監(jiān)測系統(tǒng)及分析軟件購自Noldus。

3 方法

3.1 小鼠腦組織分離及切片 在行為學實驗結(jié)束后取小鼠腦組織。戊巴比妥鈉麻醉小鼠，斷頸后快速取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定過夜。第2 天開始在4℃下分別在20%和30%蔗糖溶液中依次脫水過夜。使用冷凍切片機連續(xù)切割獲得小鼠海馬切片，保存在-80℃下。

3.2 免疫熒光實驗 BrdU（100 mg/kg）通過腹腔注射至小鼠體內(nèi)，第1 次注射后每2 h 注射1 次，共5次，注射完畢后3 周處死小鼠，取材并進行后續(xù)實驗。將腦片置于PBS 中洗滌3 次后，采用0.3% Triton 溶液處理30 min，隨后用山羊血清在37℃下封閉1 h。室溫孵育Ⅰ抗（抗DCX抗體1∶1 000，抗BrdU抗體1∶1 500）1 h 后4℃過夜。第2 天洗去Ⅰ抗后滴加熒光Ⅱ抗（1∶500）并室溫孵育1 h。隨機選取3 個視野，通過ImageJ軟件分析。

3.3 轉(zhuǎn)棒實驗 小鼠在轉(zhuǎn)棒疲勞機上訓練2 d，每天2次，每次次訓練5 min，轉(zhuǎn)棒勻速從8 r/min開始后以4 r/d的增速遞增至20 r/min。隨后進行連續(xù)3 d的測試，轉(zhuǎn)棒儀速度設置為20 r/min，記錄小鼠掉落的時間。

3.4 足跡分析 將小鼠放置在平板玻璃跑道上面，引誘動物從跑道一端行走到另一端，同時在跑道下面使用高速攝像機對動物足跡進行錄像。通過對動物行走足跡視頻的分析，即可獲得動物步態(tài)的各個參數(shù)。

3.5 曠場實驗 小鼠在曠場所在實驗室適應1 h后，分別放入曠場中，記錄5 min 的自發(fā)活動，末只小鼠行為結(jié)束后使用75%乙醇清潔曠場地板。使用Noldus 軟件記錄和分析小鼠運動總距離和中央?yún)^(qū)域運動距離。由對分組不知情的其他專業(yè)實驗人員來分析小鼠站立情況。

3.6 水迷宮實驗 將小鼠放入隨機四個象限之一作為起始象限，記錄動物找到水下平臺的時間。每只動物每天訓練4次，兩次訓練之間間隔15～20 min，連續(xù)訓練5 d。最后一次訓練結(jié)束后的第2 天，將平臺撤除，開始1 min 的探查訓練。將動物從原先平臺所在位置的對側(cè)象限放入水中，記錄動物在目標象限所花的時間和進入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測指標。

3.7 十字高架迷宮實驗 小鼠在十字高架迷宮所在實驗室適應1 h 后，分別進行十字高架迷宮實驗。開始時，將小鼠放入迷宮閉合臂中，記錄5 min 小鼠的活動后進行相關分析。

3.8 新物體識別實驗 第1 天將小鼠放入場地適應10 min。第2 天，在場地中放入2 個完全相同的A物體，記錄放入小鼠之后小鼠與這兩個物體接觸的情況。第3 天，將場地內(nèi)的其中一個物體換作B 物體，觀察小鼠5 min 內(nèi)對兩個物體的探究情況。統(tǒng)計小鼠探索A 和B 物體的時間，計算Discrimination Index。

3.9 Y 迷宮實驗 小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓練結(jié)束后，小鼠被放回飼養(yǎng)籠。1 h 后進行第2 個階段實驗。第2 個階段為檢測期，抽開新異臂隔板，小鼠由起始臂放入，在3個臂中自由活動5 min。錄像記錄5 min 內(nèi)每只小鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。兩組之間比較使用獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 母代高脂飲食對子代小鼠運動協(xié)調(diào)性的影響

小鼠足跡分析結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，高脂飲食組子代小鼠足跡角度顯著降低（P＜0.01），見圖1A。在轉(zhuǎn)棒實驗中，正常飲食組母鼠子代掉落時間逐漸增加，而高脂飲食組子代小鼠在實驗的3 d過程中，在轉(zhuǎn)棒停留的時間顯著低于正常飲食組母鼠子代（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor coordination of offspring mice.A：statistic results of the foot angle；B：the stay time on the rotarod.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖1 母代高脂飲食對子代小鼠運動協(xié)調(diào)性的影響

2 母代高脂飲食對子代小鼠運動能力的影響

本實驗通過曠場實驗研究了母代高脂飲食對子代小鼠運動能力的影響，結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，高脂飲食母鼠子代小鼠直立次數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖2A；實驗周期內(nèi)運動總距離相比于對照組顯著降低（P＜0.01），見圖2B。并且，高脂飲食母鼠子代小鼠在曠場中心停留時間相比于正常飲食母鼠子代小鼠顯著降低（P＜0.01），見圖2C。

3 母代高脂飲食對子代小鼠記憶行為的影響

本實驗通過水迷宮等實驗研究母代高脂飲食對子代小鼠記憶行為的影響，結(jié)果顯示，相比于正常飲食母鼠的子代，母代高脂飲食子代小鼠逃避潛伏期顯著升延長（P＜0.01），平臺移除后在平臺所在象限停留時間顯著降低（P＜0.01），見圖3A、B。十字高架迷宮實驗結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代相比于對照組連續(xù)兩次進入不同臂的次數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3C。在新物體識別和Y 迷宮實驗中，母代高脂飲食子代相比于對照組新物體偏好指數(shù)顯著降低（P＜0.01），見圖3D、E。

4 母代高脂飲食對子代小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代小鼠海馬齒狀回DCX染色神經(jīng)元數(shù)目相比于正常飲食母鼠的子代顯著降低（P＜0.01），說明神經(jīng)元分化程度顯著降低，見圖4A。隨后我們對DG 區(qū)神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)進行了研究，染色結(jié)果顯示，母代高脂飲食子代小鼠DG 區(qū)神經(jīng)元樹突長度明顯降低（P＜0.01），分支程度也顯著降低，見圖4B。

討 論

研究表明女性圍產(chǎn)期肥胖或高脂飲食攝入會現(xiàn)在增加子代肥胖和代謝紊亂發(fā)生率［6］，然而其是否能影響子代運動能力和學習記憶行為卻并不清楚。本實驗通過轉(zhuǎn)棒實驗和曠場實驗發(fā)現(xiàn)高脂飲食母鼠子代運動協(xié)調(diào)性和運動能力顯著下降，水迷宮實驗、新物體識別實驗結(jié)果顯示高脂飲食母鼠子代學習能力顯著下降，同時其海馬DG 神經(jīng)元分化程度和復雜程度均下降。在實驗選擇中，考慮到雌鼠具有生理周期這一現(xiàn)象，對實驗結(jié)果有較大干擾，在這里我們?yōu)榱说玫酱_切的觀察結(jié)果，只納入了雄性小鼠進行觀察，以期得到確切結(jié)論。青春后期是許多精神疾病，如精神分裂、抑郁等的高發(fā)年齡，在此我們選擇青春后期小鼠進行相關實驗。

近幾十年，肥胖已經(jīng)逐漸成為世界性的公共衛(wèi)生問題。肥胖發(fā)生的主要原因是能量攝取與支出的平衡失調(diào)，然而現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)青少年肥胖與其母親圍產(chǎn)期肥胖和高脂飲食結(jié)構(gòu)具有顯著相關性［7］。有研究報道，孕婦的營養(yǎng)條件尤其是高脂飲食，可直接影響子代棕色脂肪的正常產(chǎn)熱［8］。鄧佳等［9］報道，母鼠孕期和哺乳期高脂飲食能夠誘導子代出現(xiàn)糖脂代謝紊亂，他們同時發(fā)現(xiàn)雄性子鼠更易出現(xiàn)肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗等代謝障礙。鄧佳等［10］研究發(fā)現(xiàn)母鼠及斷乳后高脂飲食能導致子代雄鼠糖脂代謝異常和腸道菌群失調(diào)。這些結(jié)果提示我們雄性子代對母鼠高脂飲食后果的敏感性。本實驗通過16周的高脂飲食喂養(yǎng)母鼠直至哺乳期結(jié)束建立母鼠肥胖模型，選取了子代雄鼠作為主要研究對象，以觀察母鼠高脂飲食對子代運動能力和學習記憶的影響。小鼠足跡分析和轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示，母鼠高脂飲食可顯著降低子代小鼠運動協(xié)調(diào)性，而在曠場實驗中，子代小鼠垂直水平運動能力均受損。我們的實驗首次揭示了母鼠高脂飲食對子代雄性小鼠運動能力可以造成損傷。

Figure 2.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on motor ability of offspring mice.Mean±SEM. n=10.**P＜0.01 vs control group.圖2 母代高脂飲食對子代小鼠運動能力的影響

Figure 3.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on memory behavior of offspring mice.A：the escape latency in water maze experiment；B：the percentage in the target quadrant；C：the number of cross arm；D：the preference index in new object recognition（NOR）experiment；E：the preference index in Y-maze.Mean±SEM. n=8.**P＜0.01 vs control group.圖3 母代高脂飲食對子代小鼠記憶行為的影響

Figure 4.Effect of maternal high-fat diet（HFD）on neuron maturation of offspring mice.A：representative images of BrdU（red）and DCX（green）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the percentage of total BrdU+ cells that were BrdU+DCX+；B：representative images and examples of DCX（red）immunostaining in the DG and quantitative analysis of the total dendritic length of DCX+neurons in the DG.Mean±SEM. n=13.**P＜0.01 vs control group.圖4 母代高脂飲食對子代小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的影響

胚胎期是大腦等器官發(fā)育形成的關鍵時期，母體超重或肥胖可引起宮內(nèi)環(huán)境改變，導致胎兒在異常的生長環(huán)境中發(fā)育，從而精神疾病易感性上升［11］。Zilkha 等［12］報道母鼠高脂飲食可導致子鼠小鼠認知行為改變，并且子代小鼠顯示出自閉樣行為。周余蕾等［13］曾報道，母鼠高脂飲食可導致子鼠小鼠抑郁樣行為，且學習能力受損。然而這些研究都集中在母鼠孕期和哺乳期高脂飲食，母鼠長期高脂飲食導致的肥胖對子代小鼠認知和學習能力的影響并不清楚。與這些結(jié)果研究結(jié)果類似，我們的實驗結(jié)果同樣顯示出子鼠小鼠學習能力受損。在水迷宮實驗中高脂飲食母鼠子代小鼠潛伏期延長，在平臺撤去后象限停留時間縮短。同時在新物體識別和Y 迷宮實驗中，高脂飲食組子代小鼠對新物體的偏好顯著下降。同時我們發(fā)現(xiàn)在曠場實驗中，高脂飲食組子代小鼠中央停留時間下降，在高架十字迷宮中子代穿越次數(shù)降低，這些結(jié)果提示了子代小鼠可能出現(xiàn)焦慮樣行為，然而母代高脂飲食對子代焦慮情緒的影響還需要進一步的實驗證明。

在成年海馬神經(jīng)發(fā)生過程中，海馬DG 區(qū)中的成年神經(jīng)前體細胞可持續(xù)分化成成熟神經(jīng)元，這些神經(jīng)元對海馬依賴的學習記憶和空間運動能力具有重要作用［14-15］。我們對子代小鼠DG區(qū)神經(jīng)元進行了染色分析，實驗結(jié)果顯示母代高脂飲食子代小鼠DG 區(qū)神經(jīng)元分化程度顯著降低且神經(jīng)元樹突長度和分支明顯降低。我們因此考慮母代高脂飲食通過影響子代小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生損傷了小鼠運動和學習能力。

綜上所述，我們的實驗發(fā)現(xiàn)母代高脂飲食可損傷子代小鼠運動協(xié)調(diào)性和運動能力，同時小鼠顯示出學習記憶障礙，其機制可能與子代小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生損傷有關。然而本實驗結(jié)果僅來自于雄性子代小鼠，關于母代高脂飲食對子代雌性小鼠運動和學習能力的作用，以及子代性別在其中的差異及原因還需要進一步研究。