茶樹DNA去甲基化酶基因的全基因組鑒定及表達分析

陳瑤，張偉富，任恒澤，熊飛，張豪杰，姚利娜，劉瑩，王璐，王新超，楊亞軍，郝心愿

茶樹DNA去甲基化酶基因的全基因組鑒定及表達分析

陳瑤，張偉富，任恒澤，熊飛，張豪杰，姚利娜，劉瑩，王璐，王新超，楊亞軍*，郝心愿*

中國農業科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江 杭州 310008

DNA去甲基化酶（dMTase）是主動去甲基化過程中具有糖基化酶和脫嘌呤裂合酶活性的雙功能酶。基于茶樹基因組數據，本研究利用生物信息學方法對茶樹DNA去甲基化酶（）編碼基因進行了全面鑒定和序列分析。全基因組鑒定結果表明，舒茶早基因組中包含4個，系統進化分析將分為和兩個分支，基因結構分析顯示不同成員之間的基因序列長度和內含子數量存在差異。不同蛋白的理化性質相似，均包含ENDO3c和RRM_DME典型的保守結構域，且都定位在細胞核中。家族基因啟動子區域包含大量光信號響應、植物激素響應、脅迫響應和生長發育等相關順式作用元件。表達分析結果顯示，e基因在不同組織器官中均有表達，有一定的組織特異性；在炭疽菌（）、擬盤多毛孢菌（）和茶尺蠖（）等生物脅迫及干旱等非生物脅迫下，的表達均被顯著誘導；冬季休眠過程中在不同品種成熟葉和越冬芽中的表達模式存在顯著差異；在花芽發育及種子萌發的不同階段的表達存在顯著上調過程。CsdMTases介導的主動去甲基化過程在調控茶樹脅迫應答和生長發育中可能發揮了重要的作用，為深入揭示茶樹表觀調控機制提供理論依據。

茶樹；DNA去甲基化酶；逆境脅迫響應；生長發育；表達分析

DNA甲基化是表觀遺傳調控的重要機制之一，在調控基因表達、基因印記、轉座子沉默以及維持基因組穩定性中發揮重要作用。在植物中，DNA甲基化主要通過DNA甲基轉移酶將S-腺苷甲硫氨酸（-adenosyl methionine，SAM）的甲基基團轉移到胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-meC）[1]。依據甲基化的過程，可以大致分為2種類型：（1）從頭合成甲基化，即兩條鏈均未被甲基化的DNA被甲基化；（2）維持甲基化，以甲基化的DNA單鏈為模板，通過DNA復制對新生鏈進行甲基化修飾。依據甲基化的堿基位點，可以將其分為3種類型：CG、CHG、CHH（H指A、C或T）。在植物中，CG位點的甲基化由甲基轉移酶（Methyltransferase 1，MET1）維持[1]；對稱的CHG的甲基化主要由染色質甲基化酶（Chromomethylase 3，CMT3）與組蛋白抑制標記結合對未甲基化的CHG進行修飾[1]；而非對稱的CHH的甲基化的建立主要通過RNA介導的從頭合成途徑（RNA-directed DNA methylation，RdDM）完成[2]。典型的RdDM包含3個主要的步驟：RNA聚合酶Ⅳ的轉錄，從頭合成的DNA甲基化和異染色質的形成[3]。植物中3種類型的甲基化均會引起植物整體DNA甲基化水平的升高。基因組中DNA甲基化的水平不僅取決于DNA甲基化的建立與維持，也取決于DNA去甲基化的發生。DNA去甲基化是DNA甲基化的相反過程，即5-甲基胞嘧啶被未修飾的胞嘧啶替代的過程。在植物中，DNA去甲基化可以分為2類，一類是被動的去甲基化，是由于DNA復制過程中甲基轉移酶活性的喪失或甲基供體的缺乏導致甲基化無法維持，從而使整個基因組DNA甲基化水平降低[4]；另一類是主動的去甲基化，即不依賴DNA復制，由一系列酶催化的酶促反應過程。與DNA甲基化不同的是，去甲基化的完成需要包含DNA糖基化酶/裂合酶（DNA glycosylase/lysase）在內的一系列酶的催化，而不是單一的DNA甲基轉移酶。在植物DNA主動去甲基化過程中，DNA糖基化酶/裂合酶可以識別并直接去除5-meC。DNA糖基化酶通過特異性裂解N-糖基鍵切除5-meC[5]，從而啟動堿基切除修復機制。隨后，裂合酶對DNA進行切割，產生缺乏核苷酸的位點，并在切口處產生3′-羥基，DNA聚合酶向其添加未甲基化的胞嘧啶，DNA連接酶通過密封切口來完成修復過程。因此，基因組DNA甲基化的總體水平受DNA甲基轉移酶和DNA去甲基化酶（DNA demethylase，dMTase）的共同作用。

dMTase是主動去甲基化過程中具有糖基化酶和脫嘌呤裂合酶活性的雙功能酶，含有1個具有DNA結合活性的典型的雙螺旋發卡結構，主要負責識別并移除5-mC堿基、裂解DNA骨架，以便未甲基化胞嘧啶的添加。植物5-meC DNA糖基化酶歸屬DEMETER-LIKE（DML）家族，是分子量最大、功能最豐富的DNA糖基化酶。在擬南芥中已鑒定的去甲基化酶有ROS1（Repressor of silence 1），DME（Transcriptional activator demeter），DML2（Demeter-like protein 2）和DML3（Demeter-like protein 3），4個dMTase均歸屬DNA糖基化酶家族，除包含1個典型的由HhH-GPD（Helix–hairpin–helix and a Gly/Pro rich loop）組成的具有催化活性的糖基化酶結構域外，還在氮端含有1個短的富含亮氨酸的結構域以及碳端含有1個對催化活性必不可少的大結構域[6]。研究表明，DME可以激活被甲基化沉默的印跡基因的母體表達，對擬南芥胚乳建立基因組印跡至關重要[7]。ROS1可以通過去甲基化目標DNA啟動子來抑制同源依賴的轉錄基因沉默，是釋放高甲基化轉基因的轉錄沉默所必需的糖基化酶[8]。DML2和DML3可以通過去除基因5′和3′甲基化，從而保護內源基因免受潛在的甲基化危害[5]。在其他植物中，已鑒定番茄（）中含有基因3個[9]，水稻（）中6個[10]，楊樹（）中5個[11]。盡管在上述植物中基因已得到廣泛分析和鑒定，但是的保守性及多態性顯示不同植物、不同物種中的數量和功能都存在很大差異，而相對于模式草本植物而言，對多年生木本植物中家族基因的研究還有待深入。

茶樹是多年生木本經濟作物，分布地域廣，生長周期中會遇到低溫、干旱、病蟲害等生物和非生物逆境。茶樹在冷馴化階段，其基因組伴隨著DNA甲基化水平的變化，表明DNA甲基化參與茶樹的冷馴化過程，與茶樹的抗寒性息息相關[12]。DNA甲基化酶和基因在干旱脅迫過程中相對表達量呈現顯著變化[13]。當前有關茶樹DNA去甲基化酶（）的研究還不夠深入，在茶樹的生長發育以及生物脅迫調控中的作用尚不清楚。因此，本研究以公布的小葉種茶樹舒茶早基因組為參考，對茶樹家族基因進行了全面的鑒定。結合表達分析，以期揭示在茶樹生長發育（開花、種子萌發、芽休眠形成及解除）和逆境脅迫，如炭疽菌（）、擬盤多毛孢菌()、茶尺蠖（）和干旱中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

以種植于中國農業科學院茶葉研究所試驗茶園的20年生茶樹舒茶早、龍井43和碧云為試驗材料，分別采取茶樹的幼嫩葉片和頂芽用于的鑒定。

以種植于中國農業科學院茶葉研究所試驗茶園的20年生茶樹早生品種龍井43，中生品種碧云，晚生品種政和大白為試驗材料，從2018年9月下旬茶樹進入休眠期開始至翌年休眠解除止，依據芽的發育和天氣情況于茶樹休眠形成階段、深休眠階段和萌發階段采摘剪口下第一腋芽和成熟葉，用于茶樹芽和葉休眠形成及解除階段的表達分析。

以龍井43為試驗材料，采取自然生長條件下茶樹的根、莖、葉、頂芽、腋芽、花蕾和盛花用于組織特異性表達分析；參照熊飛等[14]所述的生物脅迫取樣方法，以未接種茶樹為對照，給茶樹分別接種炭疽菌、擬盤多毛孢菌、茶尺蠖處理，于12?h和24?h采取接種后的葉片用于茶樹生物脅迫下的表達分析；于2019年11月上旬采取茶樹不同階段的花用于花芽發育階段基因表達分析，同時采回種子用于茶樹種子萌發過程的表達分析，處理方法為將種子均分為兩份，一份作為萌發前基因表達量測定，另一份扒掉種皮后埋于珍珠巖中萌發，待胚根長至1~2?cm時拔出洗凈用于萌發后基因表達量測定。干旱脅迫取樣以盆栽龍井43為材料，人工氣候室正常培養（25℃，12?h光照/12?h黑暗，濕度65%），對照組正常澆水，處理組不澆水，處理18?d；每隔3?d取樣1次，每次采取每盆的第2~3片葉子，用于基因表達分析。每次采樣完畢對照組澆水。以上取樣及處理均設3個生物學重復，取樣后立即放入液氮，置于–80℃冰箱中保存備用。

1.2 家族基因鑒定

從擬南芥信息資源數據庫（https://www.arabidopsis）下載擬南芥中已知的dMTase基因序列，并利用這些序列從茶樹參考基因組[15-17]中通過Blast同源比對得到茶樹舒茶早中的基因。為了進一步驗證這些序列在茶樹中的準確性，利用Pfam數據庫31.0中的隱式馬爾可夫模型（HMM）搜索，進一步驗證了dMTase中兩個特征結構域的存在。然后，檢索已鑒定成員的基因組，轉錄本，編碼序列和蛋白序列，利用ProtParam分析程序預測蛋白分子量、等電點、氨基酸組分等。之后，設計熒光定量引物用于基因短片段的克隆驗證，PCR產物送至杭州有康生物科技有限公司進行測序，測序結果與原序列進行比對。

1.3 基因序列、結構比較分析

為了進一步了解茶樹基因結構特征，從Phytozome（www.phytozome.net），NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）和JGI（www.jgi.doe.gov）網站下載5種植物（水稻、玉米、葡萄、楊樹、擬南芥）的dMTase蛋白序列。利用clustalw進行多序列比對，采用鄰接法利用MEGA 7.0進行系統進化樹構建。利用SMART對CsdMTase進行保守結構域分析。使用Tbtools軟件對基因的進化樹和保守結構域進行分析。利用Gene Structure Display Server 2.0（GSDS）進行基因內含子-外顯子結構分析。為了分析啟動子的順式作用元件，從茶樹基因組數據集中檢索起始密碼子的上游序列（2?000?bp），利用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）工具分析啟動子順式作用元件。分析結果使用Tbtools軟件進行可視化。

1.4 核酸提取及表達分析

1.4.1 總RNA的提取及cDNA的合成

以龍井43、碧云、政和大白不同休眠階段的越冬芽、成熟葉，龍井43、碧云和舒茶早幼嫩葉片，龍井43不同開花階段的花、不同萌發狀態的種子、干旱脅迫處理的葉片、生物脅迫處理的葉片為材料，按照CTAB法提取不同處理樣品的總RNA，用NanoDrop ND2000 微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度，1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，參照PrimeScript?RT reagent Kit反轉錄試劑盒[Takara，寶生物工程（大連）有限公司]說明書反轉錄合成cDNA用于基因表達分析。

1.4.2 基因表達分析

2 結果與分析

2.1 CsdMTase家族基因鑒定及理化分析

基于同源分析，從舒茶早基因組中鑒定出4個基因（CSS0047502.1、TEA031023.1、TEA022110.1、TEA033283.1），經過NCBI-blast與其他物種dMTase蛋白序列比對，將4個基因分別命名為和基因（表2）。對鑒定出的基因進行了基本特征分析發現，基因編碼的氨基酸數目從1?800至1?943個不等，平均長度約為1?865個氨基酸；預測分子量為200.66~216.76?kDa，平均分子量約為208.49?kDa；理論pI為6.37至8.03，除CsDMEa外，其他蛋白的pI均小于7.0，為酸性蛋白；蛋白不穩定系數均大于40，表明茶樹中CsdMTase蛋白不穩定。親水性（GRAVY）分析顯示茶樹中所有的CsdMTase蛋白都是親水性蛋白。亞細胞定位結果顯示，CsdMTase蛋白均定位于細胞核中（表2）。

以茶樹舒茶早、龍井43和碧云的cDNA為模板，用表1列出的熒光定量引物為模板，對茶樹基因片段進行克隆，結果如圖1所示，在3個茶樹品種中均有條帶，測序結果顯示克隆得到基因片段與舒茶早基因序列一致，表明文中鑒定到的4個基因確實存在于茶樹中。

2.2 CsdMTase家族基因的遺傳發育樹及保守結構域

為探究茶樹基因家族的進化關系，本研究利用擬南芥、葡萄、楊樹、水稻和茶樹的CsdMTase蛋白序列構建系統進化樹。結果表明，植物中的基因可以分為和兩個分支。類基因存在于所有雙子葉植物中，但在單子葉植物中不存在（圖2）。葡萄和擬南芥都只有1個基因，而茶樹和楊樹中基因卻有2個。雖然基因存在于所有研究的植物中，但基因的個數在各個植物中不盡相同（1~6個），其中水稻中最多，為6個。

利用SMART對dMTase進行保守結構域分析（圖2），結果表明，大多數dMTase基本包含4個共同保守結構域：ENCO3c結構域（ENCO3C domain，包含HhH-GPD domain），Perm-CXXC結構域（Permuted single zf-CXXC unit，Perm-CXXC domain），RRM_DME結構域（RR DME domain）以及FES結構域（FES domain）。前人對擬南芥的研究表明ENCO3c結構域行使糖苷酶功能，Perm-CXXC結構域介導DNA 結合活性[18]。Perm-CXXC結構域和RRM_DME結構域是dMTase特異性結構域，這兩者與ENCO3c結構域共同參與dMTase活性。因此，在我們的分析中，編碼由ENCO3c結構域和DME結構域組成的蛋白質的茶樹基因被鑒定為。在茶樹中，所有的均含有ENCO3c、RRM_DME和Perm-CXXC等3個結構域。與ROS分支相比，DME分支的序列保守性更強（圖2）。

表1 茶樹CsdMTases基因家族實時熒光定量引物

表2 茶樹CsdMTases基因的基本特征

注：*是參考Wei等人[16]基因組；**是參考Xia等人[15]基因組

Note: * refers to the genome of Wei et al[16]. ** refers to the genome of Xia et al[15]

2.3 CsdMTase家族基因的結構及啟動子分析

為進一步闡明茶樹基因的結構特征，利用GSDS 2.0研究基因的外顯子-內含子結構，分析顯示基因包含15~19個外顯子（圖3-A）。其中，基因外顯子數量最多，包含19個外顯子，而和中都只含有15個外顯子。的基因長度和的相似，都含有17個外顯子。

利用Plant CARE數據庫對基因上游2?000?bp順勢作用調控元件分析顯示，基因上游含有大量順式作用元件，大致可以分為4類：光響應、植物激素響應、脅迫響應以及植物生長發育相關的作用元件。其中，激素反應元件ABRE參與脫落酸反應，CGTCA-motif和TGACG-motif涉及茉莉酸甲酯響應，GARE-motif和P-box參與赤霉素響應，TCA-element參與水楊酸適應以及AuxRR-core和TGA-box參與生長素響應。啟動子還具有多種應激反應調控元件，如參與低溫應激的LTR，參與干旱誘導的MBS，涉及防御和應激反應的TC-rich repeats以及響應厭氧誘導的ARE調控元件。另外，還確定了一些組織特異性的順式調控元件，例如參與種子特異性調控的RY-element、胚乳特異性表達所需的GCN4_motif以及與分生組織特異性激活有關的CAT-box。除此之外，還發現中含有參與玉米蛋白代謝調控的O2-site和與MYBHv1結合位點有關的CCAAT-box調控元件等。

總而言之，茶樹中最常見的順式調節元件主要與生理過程有關，例如光信號、脅迫應答和激素響應。茶樹中多種順式作用原件的存在表明基因可以參與茶樹的生長發育以及脅迫應答。

2.4 CsdMTase的組織特異性分析

利用實時熒光定量PCR技術檢測了在茶樹龍井43的組織特異性表達。結果顯示（圖4），在花蕾、腋芽、莖中表達量較高，根中表達較低；在腋芽和根中表達差異顯著；在不同組織的表達模式也不同，在花蕾中表達量最高，在腋芽和莖中的表達量較高，盛花、根和葉中的表達量較低。在花蕾和腋芽中的表達量較高，在盛花中基本不表達，而在其他組織均只有微弱的表達。

圖1 茶樹CsdMTases基因的鑒定

圖2 CsdMTase進化樹和保守結構域分析

2.5 CsdMTase在生物和非生物脅迫下的表達分析

為探究茶樹在響應生物脅迫和非生物脅迫下的潛在作用，用實時熒光定量PCR技術分析了其在炭疽菌、擬盤多毛孢菌和茶尺蠖接種處理以及干旱、休眠誘導條件下的表達。茶樹在接種炭疽菌處理12?h后，基因的所有成員表達量都達到最大值，并且與接種前相比均存在顯著性差異，隨后表達下調，至24?h時，、和的表達量仍較未處理前的高（圖5），而和未處理前趨于一致（圖5）。茶樹在接種茶尺蠖處理時，除是在接種24?h才有顯著性升高外，基因的表達模式也跟接種炭疽菌的一致。當給茶樹接種擬盤多毛孢菌時，基因的表達模式與前兩者有所差別。在接種擬盤多毛孢菌后，除外，基因的表達量持續上升，并且在24?h時達到最大。表明茶樹受到生物脅迫時短期內能夠誘導基因表達，該結果也和基因啟動子包含與脅迫應激響應的順式作用原件一致。

注：（A）茶樹CsdMTase基因的內含子-外顯子結構；（B）茶樹CsdMTase啟動子順式調控元件

在干旱脅迫下，基因的所有成員都顯示出轉錄表達量的顯著變化（圖6）。隨著干旱處理時間的延長，基因的相對表達量也相應增加，除了外，基因的其余成員均在干旱處理12?d時相對表達量達到最大，并且與干旱處理0?d時有顯著性差異。在干旱處理3?d時相對表達量有所增加，隨著干旱處理時間的延長，基因的相對表達量下調，在12?d時又有所增加，并且在18?d時達到最大，表明基因可能在干旱脅迫過程中起到調控作用（圖6）。

2.6 CsdMTase在生長發育過程中的表達分析

為探究在茶樹生長發育中的可能調控作用，利用qRT-PCR技術分析了基因在不同萌發物候型茶樹品種從秋季茶樹頂芽開始停止生長到春季萌發期間以及茶樹龍井43花芽發育階段和種子萌發過程的表達量變化。如圖7所示，在茶樹芽休眠形成階段，在茶樹早生品種龍井43（除外）、中生品種碧云以及晚生品種政和大白芽中的表達量均達到最大值；在深休眠階段，表達下調，并達到最低；而在萌發階段，表達上調，但是仍然低于休眠形成階段的水平。在萌發階段，3個品種的表達量有所差異，可能是由于3個品種休眠解除時間的不同導致。在不同萌發物候期茶樹品種芽中的表達量存在差異，并且龍井43>碧云>政和大白。其原因可能是此時龍井43已經萌發，生長較活躍；而碧云可能處于萌動階段，政和大白則可能處于休眠后期。由此可見，茶樹在芽停止生長開始到芽萌動階段的表達模式與冬季芽休眠形成及解除高度關聯。

茶樹在母葉中的表達模式（圖7-D—F）跟在芽中的有一定差別。在早生品種茶樹龍井43葉片中，、有著相同的表達模式，即在休眠形成階段，表達量處于較低水平，在萌芽階段表達量達到最大，而是在深休眠階段表達量最高，萌芽階段表達量最低，則與相反，在深休眠階段表達量達到最低，萌發階段表達顯著回升；在茶樹中生品種碧云和晚生品種政和大白中，也在休眠形成階段表達量最低。結果表明基因在不同萌發物候型茶樹芽休眠形成和解除階段過程中，在芽和母葉中的表達模式不同，對茶樹的調控作用可能不同。

注：圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

利用qRT-PCR技術分析了基因在花芽發育階段和種子萌發過程的表達量變化。由圖8可以看出，在花芽發育階段，在露白期表達顯著上調，和在開放期顯著下調。在花芽發育階段的顯著變化表明其在花的發育中起到調控作用。

注：圖中不同字母表示0.05水平上差異顯著

Note: Different letters in the figure indicate significant differences at the level of 0.05

Fig. 6 Expression analysis ofunder drought stress in Longjing 43

注：（A）和（D）為茶樹品種龍井43；（B）和（E）為茶樹品種碧云；（C）和（F）為茶樹品種政和大白。I：2018年10月25日（茶樹休眠形成階段）；Ⅱ：2019年1月14日（茶樹深休眠階段）；Ⅲ：2019年3月13日（茶樹休眠解除階段）。圖中紅色和藍色分別表示較高和較低的表達水平（與白色相比）

Note: (A) and (D) Tea plant variety Longjing 43. (B) and (E) Tea plant variety Biyun. (C) and (F) Tea plant variety Zheng he da bai. I: October 25, 2018 (Paradormancy stage of tea plants). Ⅱ: January 14, 2019 (Endodormancy stage of tea plants). Ⅲ: March 13, 2019 (Encodormancy stage of tea plants). Compared with the white color, the red and blue colors in the graph indicate higher and lower expression levels, respectively

圖7 茶樹基因在不同茶樹品種芽和葉休眠誘導下的表達分析

Fig. 7 Expression analysis ofin buds and leaves of different tea cultivars at different dormancy periods

在種子萌發前后也發生顯著變化，在萌發種子中的表達量顯著高于未萌發種子，約為萌發前的19倍；而在萌發種子中表達顯著下調，表明和可能參與胚乳的表達調控，在種子萌發過程中起作用。

3 討論

3.1 dMTases的蛋白質結構特征

DNA甲基化是影響許多生物學過程的重要表觀遺傳修飾，不僅參與基因表達的調節，而且還參與維持基因組的穩定性。dMTase可以去除甲基化并調節基因表達，與植物抗逆性密切相關，在表觀遺傳學中起著重要作用。目前，已在多種植物中進行了基因的鑒定，如擬南芥[21]、番茄[9]、蓖麻[22]、草莓[23]、花生[24]、棉花[25]等植物。本研究從茶樹舒茶早中鑒定了4條基因，其具有已報道的植物的典型特征。系統進化分析將鑒定出的4個基因分成和兩個分支，發現茶樹的與葡萄和楊樹的親緣關系更密切；Gu等[21]將草莓中基因家族的4個基因歸為兩個分支，DME類基因存在于所有的雙子葉植物中，在單子葉植物中不存在，且發現其在環境脅迫（鹽、干旱、低溫、高溫）和草莓果實生長中具有調節作用。Cao等[9]將番茄中基因家族的3個基因歸為2個分支，并發現其參與果實成熟的調控。基因結構及保守結構域分析表明，茶樹基因家族聚類關系較近的基因具有相似的基因結構，如分支的和含有相同外顯子數目。同時保守結構域的個數和種類具有一定相似性，在氮端都含有ENDO3c結構域，在碳端都含有DME結構域，這與葡萄、水稻、楊樹的dMTase蛋白保守結構完全一致（圖1）。說明這兩個結構域是dMTase高度保守的結構域，編碼由這兩個結構域組成的蛋白質的基因可以被鑒定為推定的基因。

為了確定茶樹中特定表觀遺傳基因可調控轉錄的因素，分析了它們在基因上游2?000?bp內推定的順式作用元件的啟動子序列。結果發現，的啟動子大致具有光響應、植物激素響應、脅迫響應和生長發育4類順式作用調控元件，其中脅迫響應類作用元件主要涉及低溫應激、干旱誘導以及防御和應激反應，而生長發育相關的作用原件主要與種子特異性調控和胚乳特異性表達相關。

3.2 CsdMTase基因的表達與逆境脅迫的關系

在擬南芥中，轉座因子序列（Transposable element sequences，TE）的DNA去甲基化（主要由ROS1完成）可以促進防御相關基因的表達，介導的啟動子轉座因子的DNA去甲基化對于防御相關基因表達的激活至關重要，并且dMTase調控的鐮刀菌脅迫應答相關的基因表達具有組織特異性[28]；茶樹在接種炭疽菌、茶尺蠖和擬盤多毛孢菌處理的短時間內，基因的表達水平發生顯著變化，基因相對表達量迅速增大，表明受生物脅迫的顯著誘導，茶樹通過DNA甲基化機制快速響應生物脅迫。目前，植物中dMTase對生物脅迫調節作用的相關研究還很缺乏，該結果可為日后dMTase對生物脅迫的調控作用提供依據。此外，在各種非生物脅迫下，基因的表達水平也發生了顯著變化，這表明某些關鍵基因的去甲基化可能對植物中的非生物反應至關重要。油菜中，和在鹽脅迫和高溫脅迫下均溫和上調，，和表現出對鹽脅迫的一些下調響應，而在熱脅迫下較少表達[27]；蓖麻在干旱脅迫下基因顯著上調；茶樹在干旱脅迫時基因的表達水平也顯著升高，尤其是基因的表達水平最高[13]。

注：（A）CsdMTases在茶樹花芽發育過程的表達分析，S：幼蕾期，M：露白期，L：開放期。（B）CsdMTases在茶樹種子萌發過程的表達分析，I：成熟種子，Ⅱ：萌發種子。圖中不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著；*表示P<0.05；**表示P<0.01

3.3 CsdMTase基因的表達與生長發育的關系

研究顯示，在擬南芥中，幼嫩和成年擬南芥組織中的，和基因表達量增加[21]；在楊樹中，過表達會促進楊樹的頂芽提前形成[11]，而的沉默會導致楊樹的芽萌發推遲[28]，說明DNA去甲基化作用可調控芽的生長發育；在蓖麻中，在種子發育階段顯著上調[22]，表明其可能在種子發育中具有潛在作用。在茶樹中，基因在茶樹種子萌發、花芽發育階段顯著上調，表明茶樹可能在胚乳形成中起調節作用，并且通過參與的DNA去甲基化作用調控茶樹的生長發育。在茶樹休眠形成及解除階段，基因在不同品種以及葉、芽中表達水平差異也很大，在茶樹早生品種、中生品種、晚生品種中生理休眠期顯著下調，而在生態休眠期表達量又有所上升，但是表達量依舊沒有類休眠期的高，表明基因可能在茶樹芽休眠的形成和解除過程中發揮著重要的作用。

DNA甲基化對于調節植物的發育和對環境脅迫應答至關重要，但是DNA甲基化酶和dMTase如何參與各種反應是一個復雜的過程，其機制仍不清楚。基因的差異表達分析表明，在不同逆境脅迫下，基因的表達水平發生了很大變化，一些關鍵基因可能被去甲基化。因此，DNA甲基化最有可能參與環境對茶樹生長發育的影響。本研究為茶樹中DNA甲基化對脅迫響應及其在種子萌發和花芽發育中的調控作用提供了一些線索，并為進一步探索茶樹逆境脅迫以及生長發育過程中的表觀遺傳調控機制提供了基礎。

[1] Law J A, Jacobsen S E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals [J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(3): 204-220.

[2] Cao X, Jacobsen S E. Locus-specific control of asymmetric and CpNpG methylation by the DRM and CMT3 methyltransferase genes [J]. PNAS 2002, 99(s4): 16491-16498.

[3] Duan C G, Zhu J K, Cao X. Retrospective and perspective of plant epigenetics in China [J]. J Genet Genomics, 2018, 45(11): 621-638.

[4] Rocha P S, Sheikh M, Melchiorre R, et al. Thehomology-dependent genegene codes for an S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase required for DNA methylation-dependent gene silencing [J]. Plant Cell, 2005, 17(2): 404-417.

[5] Jon P, Huh J H, Tracy Ballinger, et al. DNA demethylation in thegenome [J]. PNAS 2007, 104(16): 6752-6757.

[6] Zhang H, Lang Z, Zhu J K. Dynamics and function of DNA methylation in plants [J]. Nat Rev Mol Cell Bio, 2018, 19(8): 489-506.

[7] Yeonhee Choi M G. Demeter, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in[J]. Cell Press, 2002, 110(1): 33-42.

[8] Gong Z Z, Teresa M R, Rafael R A, et al. ROS1, a repressor of transcriptional gene silencing in, encodes a DNA glycosylase/lyase [J]. Cell Press, 2002, 111(6): 803-814.

[9] Cao D, Ju Z, Gao C, et al. Genome-wide identification of cytosine-5 DNA methyltransferases and demethylases in[J]. Gene, 2014, 550(2): 230-237.

[10] Zemach A, Kim M Y, Silya P, et al. Local DNA hypomethylation activates genes in rice endosperm [J]. PNAS 2010, 107(43): 18729-18734.

[11] Conde D, Moreno C A, Dervinis C, et al. Overexpression of Demeter, a DNA demethylase, promotes early apical bud maturation in poplar [J]. Plant Cell and Environment Plant Cell Environ, 2017, 40(11): 2806-2819.

[12] 周艷華, 曹紅利, 岳川, 等. 冷馴化不同階段茶樹DNA甲基化模式的變化[J]. 作物學報, 2015, 41(7): 1047-1055. Zhou Y H, Cao H L, Yue C, et al. Changes of DNA methylation levels and patterns in tea plant () during cold acclimation [J]. Acta Agronomica Sinica, 2015, 41(7): 1047-1055.

[13] Zhu C, Zhang S, Zhou C, et al. Genome-wide investigation and transcriptional analysis of cytosine-5 DNA methyltransferase and DNA demethylase gene families in tea plant () under abiotic stress and withering processing [J]. Peer J, 2020, 8: e8432. doi: 10.3389/fpls.2016.00007.

[14] 熊飛, 盧秦華, 房婉萍, 等. 基于全基因組的茶樹PAL家族基因鑒定及其在生物與非生物脅迫下的表達分析[J]. 園藝學報, 2020, 47(3): 517-528. Xiong F, Lu Q H, Fang W P, et al. Genome-wide identification and expression analyses ofgenes under biotic and abiotic stress in[J]. J Hortic, 2020, 47(3): 517-528.

[15] Xia E, Tong W, Hou Y, et al. The reference genome of tea plant and resequencing of 81 diverse accessions provide insights into genome evolution and adaptation of tea plants [J]. Mol Plant, 2020, 13(7): 1013-1026.

[16] Wei C, Yang H, Wang S, et al. Draft genome sequence ofvar.provides insights into the evolution of the tea genome and tea quality [J]. PNAS 2018, 115(18): E4151-E4158.

[17] Xia E H, Li F D, Tong W, et al. Tea plant information archive: a comprehensive genomics and bioinformatics platform for tea plant [J]. Plant Biotechnol J, 2019, 17(10): 1938-1953.

[18] Hao X, Horvath D P, Chao W S, et al. Identification and evaluation of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plant ((L.) O. Kuntze) [J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(12): 22155-22172.

[19] Thomas D. Analyzing real-time PCR data by the comparative CTmethod [J]. Protocol, 2008, 3(6): 1101. doi: 10.1038/nprot.2008.73.

[20] Mok Y G, Uzawa R, Lee J, et al. Domain structure of the DEMETER 5-methylcytosine DNA glycosylase [J]. PNAS 2010, 107(45): 19225-19230.

[21] Ogneva Z V, Dubrovina A S , Kiselev K V . Age-associated alterations in DNA methylation and expression of methyltransferase and demethylase genes in[J]. Biol Plantarum, 2016, 60(4): 628-634.

[22] Victoria D, Aliki K, Venetia K, et al. Spatial and temporal expression of cytosine-5 DNA methyltransferase and DNA demethylase gene families of theduring seed development and drought stress [J]. Plant Growth Regul, 2017, 84(1): 81-94.

[23] Gu T T, Ren S A, Wang Y H, et al. Characterization of DNA methyltransferase and demethylase genes in[J]. Mol Genet Genomics, 2016, 291(3): 1333-1345.

[24] Wang P F, Chao G, Bai X T, et al. Genome-wide identification and comparative analysis of cytosine-5 DNA methyltransferases and demethylase families in wild and cultivated peanut [J]. Front Plant Sci, 2016, 7: 7. doi: 10.3389/fpls.2016.00007.

[25] Yang X M, Chen X G, Wang D L. Genome-wide identification and expression analysis of DNA demethylase family in cotton [J]. J Cotton Res, 2019, 2(2): 142-150.

[26] Ulrike S, Joanne L, Kemal K, et al. DNA-demethylase regulated genes show methylation-independent spatiotemporal expression patterns [J]. Front Plant Sci, 2017, 8: 1449. doi: 10.3389/fpls.2017.01449.

[27] Fan S, Liu H, Liu J, et al. Systematic analysis of the DNA methylase and demethylase gene families in rapeseed (.) and their expression variations after salt and heat stresses [J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(3): 953. doi: 10.3390/ijms21030953.

[28] Conde D, Le G A, Perales M, et al. Chilling-responsive Demeter-Like DNA demethylase mediates in poplar bud break [J]. Plant Cell Environ, 2017, 40(10): 2236-2249.

Genome-wide Investigation and Expression Analysis of DNA Demethylase Genes in Tea Plant ()

CHEN Yao, ZHANG Weifu, REN Hengze, XIONG Fei, ZHANG Haojie, YAO Lina, LIU ying, WANG Lu, WANG Xinchao, YANG Yajun*, HAO Xinyuan*

Tea Research Institute of the Chinese Agriculture Science/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

DNA demethylase (dMTase) is a bifunctional enzyme with activities of glycosylase and apyrimidic lysase during active demethylation. Based on the available genome data of tea plant, bioinformatics analysis was used to comprehensively identify DNA demethylases () in tea plant. The genome-wide identification results show that the tea cultivar Shuchazao contains 4. Thesecould be divided into two branches (and) with differences in gene length and intron number by phylogenetic and gene structure analysis. Further analysis shows that the physical and chemical properties of different CsdMTase proteins are similar, which contain the typical conserved domains of ENCO3c and RRM_DME and are located in the nucleus. The promoter regions ofcontain a large number of-acting components related to light response, plant hormone response, stress response and growth and development. Thegenes are expressed in all detected tissues with certain tissue specificity. The expressions ofwere significantly up-regulated under biotic stresses, including,andtreatments. During winter dormancy, different expression patterns ofwere detected in mature leaves and overwintering buds of different cultivars. The expressions ofandat different stages of flower bud development and seed germination were significantly induced. The results show that active DNA demethylation process mediated byplays a crucial role in regulating the stress responses, growth and development of tea plant, providing a theoretical basis for discovering the epigenetic regulation mechanism in tea plant.

tea plant, DNA demethylase, stress response, growth and development, expression analysis

S571.1；Q523

A

1000-369X(2021)01-028-12

2020-05-27

2020-06-17

國家自然科學基金（31972461）

陳瑤，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種研究。*通信作者：yjyang@tricaas.com，haoxy@tricaas.com

（責任編輯：趙鋒）