3種抗生素處理對灰茶尺蛾內生菌群的影響

王志博，白家赫，周孝貴，郭華偉，肖強

3種抗生素處理對灰茶尺蛾內生菌群的影響

王志博，白家赫，周孝貴，郭華偉，肖強*

中國農業科學院茶葉研究所，農業農村部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008

為明確不同抗生素對灰茶尺蛾內共生菌群落的影響，分別選用質量濃度2.5?mg·mL-1的四環素、頭孢氨芐、利福平3種抗生素溶液浸泡新鮮茶樹葉片持續飼喂灰茶尺蛾幼蟲3代，通過16?S rDNA高通量測序技術對內生菌群群落變化展開研究，并進一步基于基因分子標記對灰茶尺蛾沃爾巴克氏體菌去除效果進行檢測。結果表明，3種抗生素處理后，灰茶尺蛾菌群落均表現為豐富度增加、多樣性減??；四環素和利福平飼喂處理能夠成功將灰茶尺蛾沃爾巴克氏體菌去除，進而建立了不攜帶沃爾巴克氏體菌的灰茶尺蛾種群，為進一步開展沃爾巴克氏體菌的功能研究奠定了基礎。

灰茶尺蛾；共生菌；沃爾巴克氏體；抗生素

昆蟲體內棲息了大量的微生物，它們與宿主之間長期的協同進化過程中形成了相互依存的共生關系[1]。這些共生菌在宿主免疫、代謝、生殖等方面發揮了重要作用，因此，利用昆蟲共生菌開發新型害蟲防治技術具有重要的應用前景[2]。沃爾巴克氏體（）是廣泛共生于自然界節肢動物宿主細胞內的一類革蘭氏陰性細菌，可通過多種方式調節宿主的生殖方式[3]。其中細胞質不親和（Cytoplasmic Incompatibility，CI）現象是最常見的表型，其特征為感染沃爾巴克氏體的雄性和未感染或感染不同沃爾巴克氏體品系的雌性宿主交配后，受精卵不能正常發育，在胚胎期死亡[4-5]?；谠摾碚撻_發出了利用沃爾巴克氏體防治蚊媒病的新型技術，該項技術已經在阻止登革熱和寨卡病毒傳播中成功應用[6-7]。

灰茶尺蛾（Warren）和小茶尺蠖（Prout）是茶園中最主要的1對近緣種食葉類害蟲，二者形態相似，分布區域部分重疊[8]。前期研究發現二者能夠交配并產生不可育的后代，且存在生殖競爭行為[9-10]。近期的研究發現二者共生菌群存在顯著差異，特別是灰茶尺蛾體內自然攜帶沃爾巴克氏體，而小茶尺蠖不攜帶[11]。沃爾巴克氏體的差異是否介導了兩種茶尺蠖生殖隔離？這是我們一直關注的科學問題。開展該方面的研究首先要建立不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾品系。目前，對于昆蟲共生菌去除手段主要以抗生素處理為主，具體操作形式有顯微注射和飼喂兩種方法[12-13]。馮宏祖等[14]使用頭孢氨芐飼喂處理蘋果蠹蛾成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體蘋果蠹蛾品系。任素麗等[15]使用利福平飼喂處理Q型煙粉虱發現，利福平對其體內共生菌有良好的去除效果。謝蓉蓉等[16]使用四環素喂食處理二斑葉螨成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體的二斑葉螨品系。上述研究結果均證明使用抗生素喂食處理是獲得不攜帶某種共生菌品系的有效手段，但不同種類抗生素處理昆蟲也會對其自身的免疫系統帶來不同程度的傷害[17]。目前，選用何種抗生素能夠達到去除灰茶尺蛾體內沃爾巴克氏體，同時保證其種群正常生長發育尚不清楚。本研究選取3種抗生素（四環素、頭孢氨芐、利福平）對灰茶尺蛾進行飼喂處理以明確不同抗生素對沃爾巴克氏體的去除效果及其共生菌群落的影響，為進一步開展沃爾巴克氏體介導茶尺蠖兩近緣種生殖隔離及遺傳防治應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

灰茶尺蛾采自浙江省新昌縣（120.99° E，29.50° N）。野外收集灰茶尺蛾幼蟲后帶回實驗室進行人工飼養。飼養條件：(25±1)℃；光周期為13?h/11?h（L/D）；相對濕度為75%~80%。采摘新鮮茶葉（迎霜品種）每天喂食，直至化蛹。將蛹按雌雄分開，待成蟲羽化后，將雌雄成蟲各兩對置于500?mL養蟲瓶中配對，同時在養蟲瓶中放入2個產卵條[18]。

1.2 抗生素處理

選擇四環素、頭孢氨芐、利福平3種抗生素（麥克林公司，上海），配制質量濃度為2.5?mg·mL-1溶液分別對新鮮茶樹葉片進行浸液處理1?min?？股靥幚磉^的葉片置于25℃、相對濕度為50%~60%條件下進行攤晾，待葉片表面溶液完全干后（約5?h），取適量處理過的茶葉對灰茶尺蛾進行喂食，并將處理組進行標記。每個世代取羽化2日齡成蟲用于沃爾巴克氏體去除效果檢測。連續處理3個世代后，對羽化2日齡的成蟲進行隨機取樣用于共生菌群落測序。每個處理組和對照組選取雌雄蟲各5頭，每頭樣本單獨保存在2?mL離心管中置于–80℃冰箱中待后續研究。

1.3 樣品DNA提取

樣品DNA提取采用試劑盒提取法。將樣品成蟲的翅用剪刀除去，剩余部分裝入2?mL的滅菌EP管中并加入1粒4?mm的滅菌鋼珠，置于振蕩研磨器上研磨2?min。待樣品研磨完成后按照血液/組織DNA提取試劑盒（天根生物技術有限公司，北京）操作手冊逐步提取樣品DNA，并保存于–20℃冰箱中備用。

1.4 共生菌群落擴增與測序

對DNA樣本的16?S V3-V4變異區序列進行PCR擴增（引物341F：CCTACGGGNGGC WGCAG；805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC）[19]。擴增條件為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，46℃退火20?s，65℃延伸30?s，5個循環；94℃變性20?s，55℃退火20?s，72℃延伸30?s，20個循環；最后72℃延伸5?min[11]。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠檢測，之后由浙江天科公司使用Illumina的MiSeq測序儀進行測序。

1.5 Wolbachia去除效果檢測

使用的特異性引物_F1：GTCCAATARSTGATGARGAAAC；_R1：CYGCACCAAYAGYRCTRTAAA擴增基因進行去除效果檢測[11]。擴增條件為：95℃預變性3?min；95℃變性1?min，59℃退火1?min，72℃延伸90?s，35個循環；最后72℃延伸10?min。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.6 數據分析

共生菌測序成功序列使用PEAR（V1.2.11）對每個樣品的reads進行拼接，進一步對數據過濾得到有效數據（Effective tags）。利用Uparse軟件（Uparse V8.1.1861）對所有樣品的全部Effective tags進行聚類將序列聚類成為OTUs，對OTUs代表序列進行物種注釋，用Uclust方法與Silva數據庫（www.arb-silva.de）進行物種注釋分析。使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods_coverag指數[11]。樣品間差異性檢驗使用SPSS 17.0 （IBM）軟件Tukey檢驗法，<0.05代表具有顯著差異，<0.01代表具有極顯著差異。

2 結果分析

2.1 灰茶尺蛾體內共生菌種群組成的差異序列拼接與注釋

本研究共對4個處理（利福平L組、頭孢氨芐T組、四環素S組、空白對照CK組，每組10頭樣本）的40頭灰茶尺蛾樣本進行了16?S rDNA的高通量測序，測序結果及質檢信息見表1。每個樣品的Q20值均大于98%，Goods_coverage值均大于0.99，代表該測序結果的準確性和注釋覆蓋率高，可滿足后續分析要求。本次測序共獲得了1?472?992條原始數據（每條平均長度為416?bp），經過質量控制和篩選后共得到1?281?916條有效tags用于后續分析。以97%的一致性作為相似性的閾值將序列聚類為598個OTUs，共注釋到了22個門，40個綱，90個目，135個科，241個屬，157個種。

我們對4個組別的OTUs進行比較分析。4個組別共注釋到598個OTUs，其中43個核心OTUs在4個組中均有注釋。核心OTUs經鑒定隸屬于厚壁菌門Firmicutes（4科），變形菌門Proteobacteria（15科），放線菌門Actinobacteria（6科），擬桿菌門Bacteroidetes（鞘脂桿菌科Sphingobacteriaceae），微桿菌科門Microbacteriaceae（皮桿菌科Dermabacteraceae），軟壁菌門Tenericutes（支原體科Mycoplasmataceae）。其中豐度最高的均來自腸球菌科Enterococcaceae（厚壁菌門），無漿體科Anaplasmataceae（變形菌門）和腸桿菌科Enterobacteriaceae（變形菌門），平均豐度分別為29.6%，28.2%和15.2%。L組與CK組相比，共有的OTUs 51個，獨有的159個，被去除的40個；T組與CK組相比，共有的OTUs 69個，獨有的168個，被去除的27個；S組與CK組相比，共有的OTUs 65個，獨有的206個，被去除的31個（圖1）。由此可見，抗生素去除掉了宿主自身的部分菌種同時也打破了原有菌落的平衡，而一些新菌種也會在宿主體內定植。

2.2 灰茶尺蛾體內共生菌的多樣性和豐度差異

使用Alpha Diversity指數對每個樣本的多樣性和豐富度進行分析（圖2），Shannon和Simpson指數反映菌群的多樣性，指數越大多樣性越高；Ace和Chao1指數反映樣品中菌群的豐富度，指數越大豐富度越高。從Shannon和Simpson指數來看，對照CK組最大，分別為2.56和0.70，顯著高于L組（1.43，0.42）和T組（0.56，017），與S組（1.97，0.47）并未形成顯著差異。從Ace和Chao1指數來看，對照組最小，分別為52.17和47.96。極顯著小于L組（83.26，80.60）和T組（92.76，87.90），但與S組（85.00，86.78）差異不顯著。綜合分析顯示，使用3種抗生素處理后，灰茶尺蛾菌群均呈現出豐富度增加，多樣性減小的變化規律，其中以頭孢氨芐處理組最為明顯。

注：韋恩圖代表不同組別OTUs組成；右邊代表共有的43個核心OTUs中豐度大于1%的菌群

注：*代表與對照組存在顯著差異（P<0.05）；**代表與對照組存在極顯著差異（P<0.01）

2.3 不同抗生素處理灰茶尺蛾樣本相似度分析

基于OTUs注釋結果對40個樣品進行了PCoA相似性分析（圖3），圖中各點代表樣品，點間距離越近代表樣品在共生菌群組成上相似度越高。

分析結果顯示，4個組別的灰茶尺蛾樣品分布于相對獨立的區域，說明4個組共生菌組成具有較為明顯的差異。4個組別中樣品相似度最高的為T組，其樣品主要分布于第四象限；對照CK組中除樣品G1外，其他樣品全部分布在第二象限；L組和T組二者共生菌組成相對相似，樣品主要分布在一、二、三象限，且組內樣品間差異較其他兩個組更大。

2.4 灰茶尺蛾體內共生菌群落種類及豐度差異

根據OTUs的注釋結果，對照CK組獲得的371?549條有效tags聚類為96個OTUs，共生菌群落注釋到了10個門，19個綱，34個目，58個科，75個屬，40個種；利福平處理L組獲得的279?444條有效tags聚類為210個OTUs，共生菌群落注釋到了13個門，27個綱，57個目，82個科，134個屬，87個種；頭孢氨芐處理T組獲得的363?010條有效tags聚類為237個OTUs，共生菌群落注釋到了15個門，30個綱，61個目，89個科，136個屬，65個種；四環素處理S組獲得的267?913條有效tags聚類為271個OTUs，共生菌群落注釋到了17個門，30個綱，60個目，97個科，154個屬，111個種（表2）。

在門的水平（圖4），4個組別共生菌均以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門為主，但在不同的組別中菌落的相對豐度有所差異。在對照CK組中主要共生菌豐度排名依次為變形菌門（79.13%），放線菌門（14.06%），厚壁菌門（5.13%）；在L組中排名依次為厚壁菌門（65.39%），變形菌門（30.15%），放線菌門（2.47%）；在T組中排名依次為變形菌門（94.74%），厚壁菌門（5.06%），擬桿菌門（0.06%）；在S組中排名依次為厚壁菌門（45.47%），變形菌門（33.79%），放線菌門（13.04%）。

圖3 樣品相似性PCoA分析

表2 灰茶尺蛾及不同處理組共生細菌分類的基本信息

在屬的水平（圖5），各組別共生菌群落組成差異較大。對照CK組中主要共生菌豐度排名前5的依次為沃爾巴克氏體屬（，28.97%），腸球菌屬（，24.17%），假單胞菌屬（，14.82%），節桿菌屬（，7.74%），蜜蜂球菌屬（，5.09%）；L組中排名依次為蜜蜂球菌屬（，61.12%），沙雷氏菌屬（，15.63%），假單胞菌屬（1.11%），鞘氨醇單胞菌屬（，0.39%），節桿菌屬（，0.28%）；T組中排名依次為沃爾巴克氏體屬（84.05%），假單胞菌屬（8.10%），蜜蜂球菌屬（4.99%），鞘氨醇單胞菌屬（1.84%），沙雷氏菌屬（0.21%）；S組中排名依次為蜜蜂球菌屬（43.50%），沙雷氏菌屬（11.72%），鏈霉菌屬（，7.57%），泛菌屬（，5.13%），鞘氨醇單胞菌（3.71%）。以對照CK組的主要共生菌的變化比較分析發現，L和S組中5類共生菌呈現出相對一致的變化趨勢。沃爾巴克氏體在L和S組中基本消除，但在T組中卻呈現了更高的豐度占比；腸球菌屬和節桿菌屬在3個處理組中均只有很小的豐度占比；假單胞菌屬在3個處理組中與對照組相比未呈現顯著差異，但均呈現降低的趨勢，尤其在L和S組中更為明顯；蜜蜂球菌屬在L和S組呈現顯著上升趨勢，但在T組中未發生顯著變化（圖6）。

2.5 灰茶尺蛾體內共生菌沃爾巴克氏體的去除效果

在使用抗生素對灰茶尺蛾進行處理過程中，每個世代取6個樣品使用基因作為分子標記對沃爾巴克氏體進行檢測。檢測結果顯示，使用抗生素處理1代后，3種抗生素處理組樣品中均能檢測到沃爾巴克氏體（S組中1個樣品除外）（圖7-A），說明使用3種抗生素飼喂處理灰茶尺蛾1個世代均不能將沃爾巴克氏體去除?？股剡B續處理2代后，L組和S組所有樣品均檢測不到沃爾巴克氏體，但T組所有樣品中均能檢測到沃爾巴克氏體，說明使用利福平或四環素抗生素連續處理灰茶尺蛾2個世代能夠將沃爾巴克氏體去除，但頭孢氨芐不能將其去除（圖7-B）。抗生素連續處理3代后，T組中依然能夠檢測出沃爾巴克氏體，說明頭孢氨芐對沃爾巴克氏體的去除效果并不理想（圖7-C）。停用四環素10代后隨機選取10個樣品檢測顯示，該組群依然不攜帶沃爾巴克氏體并且生長發育正常（圖8）。

3 討論

昆蟲共生菌是一類生活在昆蟲體內與昆蟲互相依賴、影響并協同進化的微生物[21]。昆蟲共生菌種類與其棲息宿主環境及宿主自身的免疫、食性等多種因素相關[1]。因此，不同昆蟲類群中共生菌種類和數量也存在一定程度上的差異。例如等翅目白蟻（）腸道優勢共生菌為螺旋體門（Spirochaetes）、厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門[22]；半翅目褐飛虱（）腸道優勢共生菌為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門[23]；鱗翅目中家蠶（）、小菜蛾（）、海灰翅夜蛾（）等腸道優勢共生菌主要以變形菌門、厚壁菌門和放線菌門細菌為主[24]。雖然親緣關系相近的昆蟲共生菌在高級階元具有相似性，但不同物種間在低級階元依然存在著差異。以常見的幾種鱗翅目昆蟲為例，稻縱卷葉螟（）優勢共生菌為類諾卡氏屬（）和鞘脂單胞菌屬（）[25]；甜菜夜蛾（）優勢共生菌為不動桿菌屬（）和噬氫菌屬（）[26]；而在家蠶中不同品系其優勢共生菌在屬水平上的組成也存在差異[27]。在本研究中，灰茶尺蛾優勢共生菌為沃爾巴克氏體（28.97%）、腸球菌屬（24.17%）和假單胞菌屬（14.82%），其中沃爾巴克氏體作為一類主要存在于節肢動物體內的共生細菌，其在宿主中的多種生殖調控機制是引起研究者廣泛關注并持續開展探索的科學問題。由此可見，每種昆蟲共生菌群落組成具備各自的特點，這種多樣性也為研究共生菌功能及其與寄主之間的互作提供了充分的條件。

圖4 樣品主要共生菌相對豐度門水平的比例

圖5 樣品主要共生菌相對豐度屬水平的比例

注：*代表與對照組存在顯著差異（P<0.05）

圖7 3種抗生素處理灰茶尺蛾后沃爾巴克氏體檢測

圖8 四環素停用10代后沃爾巴克氏體檢測

本研究選擇了3種抗生素（四環素、頭孢氨芐、利福平）對灰茶尺蛾進行了飼喂處理以探索不同抗生素對沃爾巴克氏體去除效果及共生菌群落的影響。選取的3種抗生素在其他昆蟲物種上均有除去沃爾巴克氏體的成功先例，但對灰茶尺蛾體內沃爾巴克氏體的去除效果卻呈現了明顯差異。使用四環素和利福平飼喂處理灰茶尺蛾兩個世代后均能成功去除沃爾巴克氏體；而使用頭孢氨芐連續飼喂處理灰茶尺蛾3個世代依然未能達到去除沃爾巴克氏體的效果。這可能與各抗生素抗菌機理不同有關。四環素主要通過干擾氨酰-tRNA與核糖體的結合而抑制細菌蛋白質的合成，對革蘭氏陽、陰性細菌、細胞內支原體、衣原體和立克次體均有抑制效果[28]。頭孢氨芐的抑菌機理是通過抑制細菌細胞壁的合成，使細胞內容物膨脹至細胞自溶，從而達到殺菌作用。頭孢氨芐對革蘭氏陽、陰性細菌均有抑制效果。利福平的抑菌機理是通過和依賴于DNA的RNA多聚酶的亞基結合，抑制細菌RNA的合成，從而阻斷RNA轉錄過程，達到阻止DNA和蛋白的合成效果[13]。因此，3種抗生素飼喂處理灰茶尺蛾后對其共生菌群落影響也存在差異，推測可能頭孢氨芐不能很好的抑制沃爾巴克氏體細胞壁的合成。目前，已有一些使用抗生素對不同昆蟲體內沃爾巴克氏體去除效果的相關報道[12-13]，但對其作用機理方面尚未見報道。即使同種抗生素對不同昆蟲體內沃爾巴克氏體去除效果也存在差異。由此可見，抗生素對沃爾巴克氏體的去除機制研究中不僅涉及了抗生素自身的抑菌機理而且與寄主體內微環境及抗菌肽等多種因素相關?，F有的研究顯示，尚無成功分離培養沃爾巴克氏體的相關報道，一定程度上限制了對其功能作用的研究。本文首次對抗生素影響灰茶尺蛾共生菌群效果進行研究，結果顯示，四環素和利福平對灰茶尺蛾優勢菌群（排名前5）中沃爾巴克氏體屬、腸球菌屬和節桿菌屬均有顯著的去除效果；而頭孢氨芐僅對腸球菌屬和節桿菌屬具有顯著的去除效果。另外，頭孢氨芐處理后沃爾巴克氏體，四環素和利福平處理后蜜蜂球菌屬的相對豐度均顯著提高。這可能與菌群之間的抑制作用有關，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究選了的3種抗生素對灰茶尺蛾進行了飼喂處理，通過分子標記檢測，四環素和利福平連續飼喂灰茶尺蛾兩個世代后均能達到去除沃爾巴克氏體的效果。而使用分子對停用四環素10代后樣品檢測顯示，該種群依然不攜帶沃爾巴克氏體并且生長發育正常。通過上述方法首次成功建立了不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群。目前，現有的研究顯示沃爾巴克氏體能夠通過多種機制調控宿主的生殖行為，常表現為誘導宿主發生細胞質不親和（CI）、雄性致死（MK）、誘導孤雌生殖（PI）、雌性化（Feminization）、增強雌性繁殖力和雄性生育力等[3]。此外，沃爾巴克氏體對宿主的營養代謝、抗逆能力等方面同樣具有調控作用[21]。不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群的建立實現了開展沃爾巴克氏體在宿主灰茶尺蛾中功能研究的可能性，特別是在灰茶尺蛾與其近緣種茶尺蠖二者間生殖隔離機制研究方面具有重要的意義。沃爾巴克氏體通過何種方式調控茶尺蠖兩近緣種之間的生殖行為？沃爾巴克氏體是否是二者分化早期的驅動因素？這些科學問題也是我們獲得了不攜帶沃爾巴克氏體的灰茶尺蛾種群之后計劃開展的研究方向。

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Effect of Three Antibiotic Treatments on Bacterial Endosymbiont Community ofWarren

WANG Zhibo, BAI Jiahe, ZHOU Xiaogui, GUO Huawei, XIAO Qiang*

Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China

In order to study the effects of three antibiotics on bacterial endosymbiont community of, relative experiment was carried out with three antibiotics (tetracycline, cefalexin and rifampicin) at the concentration of 2.5?mg·mL-1. Larvae ofwere fed the tea leaves with antibiotics for continuous 3 generations. Variation of endosymbiont community was studied using 16?S rDNA Illumina MiSeq technique. Besides, theofwere detected basing ongene.The results show thatabundance and diversity of endosymbiont community inwere increased and reduced,respectively under antibiotic treatments. The tetracycline and rifampicin could effectively removefromFurther, the population ofwithoutwas established, which laidthefoundationfor thestudy on functionof

, symbiotic bacteria,, antibiotics

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2021)01-090-11

2020-08-12

2020-09-30

國家自然科學基金（31700613）、中國農業科學院創新工程（CAAS-ASTIP-TRICAAS）

王志博，男，副研究員，主要從事茶園病蟲害防治研究，wangzhibo9527@163.com。*通信作者：xqtea@vip.163.com

(責任編輯：趙鋒)