常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病研究進展

胡寧寧 楊怡青 戴選彤 林芙君 蔣更如

Ⅳ型膠原是構成腎小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)的主要成分，為GBM中其他細胞外基質提供網狀骨架支撐。Ⅳ型膠原有6種膠原鏈，即α1～α6，分別由COL4A1～COL4A6基因編碼，α1-α1-α2鏈和α3-α4-α5鏈分別互作聚合形成Ⅳ型膠原α112和α345 兩種三聚體。α1-α1-α2鏈在腎臟發育過程中被交聯程度更高、抗蛋白水解能力更強的α3-α4-α5鏈所替代，因而成熟的GBM中僅存在Ⅳ型膠原α345三聚體。近年來，學者基于發病機制，將編碼Ⅳ型膠原α3-α4-α5鏈的3個基因COL4A3、COL4A4、COL4A5任一突變導致GBM結構和功能異常的相關遺傳性腎小球疾病統稱為Ⅳ型膠原相關腎病(collagen Ⅳ-related nephropathy)[1]，其疾病譜包括Alport綜合征(Alport syndrome, AS)、薄基底膜腎病(thin basement membrane nephropathy, TBMN)，以及由于COL4A3或COL4A4或COL4A5基因突變所致的局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)。隨著二代測序(next generation sequencing，NGS)在臨床應用的普及，兒童和成人CKD患者中Ⅳ型膠原相關腎病的檢出率顯著提高。值得關注的是，COL4A3或COL4A4基因雜合突變導致的常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的實際發病率并不低，約占所有CKD患者的0.3%～1.0%[2-4]。因此，重視該類患者的早期診斷并行積極治療對人群CKD的整體防治具有重要意義。

1 常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的臨床疾病譜

由COL4A3或COL4A4基因雜合突變導致的常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病臨床表型的異質性較強。相關異質性和診斷分型見圖1。患者大多僅表現為孤立性鏡下血尿或合并非腎病綜合征程度和微量蛋白尿，部分患者在血尿、蛋白尿的基礎上發生腎功能減退，另有少部分患者在平均30歲前即進展為終末期腎病(end stage renal disease, ESRD)且合并眼、耳等腎外表現。腎臟病理亦呈異質性，從單純的GBM變薄到GBM發生厚薄不均、致密層撕裂分層樣改變，部分可合并FSGS樣改變。

ADAS為常染色體顯性遺傳Alport綜合征圖1 常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病臨床表型異質性和診斷分型[5]

既往根據腎臟病理形態命名的TBMN是導致兒童和成人持續性鏡下血尿的常見病因，在人群中所占比例高達1%[6]。TBMN以GBM彌漫變薄為病理特征。1995年WHO提出成人的GBM閾值為250 nm，2～11歲兒童為180 nm[7]。1966年,McConville等[8]首次公布了一組以持續性血尿為主要表現，而無高血壓、水腫、蛋白尿、腎功能不全的患者資料；其中，行腎活組織檢查(簡稱活檢)的患者，僅個別患者系膜細胞輕度增生；而家系調查發現大部分患者有血尿家族史, 故稱為“良性家族性血尿”。Voskarides等[9]研究發現，TBMN患者的腎臟預后并非均為良好。患者在疾病早期多為腎性血尿，腎活檢僅見GBM彌漫變薄；30歲后約半數患者出現顯性蛋白尿，在GBM彌漫變薄的基礎上合并FSGS；50歲后約2/3患者發生不同程度的腎功能減退。1996年，Lemmink等[10]通過基因連鎖分析首次明確COL4A4基因為TBNM的致病基因。據統計，約40%～69%的TBMN由COL4A3或COL4A4基因雜合突變引起[11-12]。近期國外一項meta分析[13]提示，在COL4A3和(或)COL4A4基因雜合突變的TBMN和(或)ADAS患者中，約29%發展為CKD，15%在約53歲時進展為ESRD。因此，TBMN這一疾病命名并不能完全反映疾病的發展進程。

此外，隨著NGS的推廣應用，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因目前被證實是遺傳性FSGS的首要致病基因。在家族性FSGS和散發性FSGS中，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變分別約占47.3%和10.0%[14]。不同于經典的AS，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變導致的FSGS患者起病較早，多數有腎性血尿、GBM異常、家族史，30歲以后逐漸發展成ESRD，無明顯的眼、耳等AS特征性腎外表現。光學顯微鏡下可見典型的節段性硬化，電子顯微鏡(簡稱電鏡)下見足突消失，但GBM無AS腎臟典型的病理表現(腎小球GBM厚薄不均，致密層撕裂、分層、蟲蝕樣或籃網樣改變)。COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變導致FSGS的機制假說：①GBM病變繼發足細胞損傷。一方面，COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變引起正常Ⅳ型膠原α345三聚體合成與胞外分泌減少，導致GBM抵抗腎小囊內靜水壓等機械壓力的能力減弱，穩定性降低[15]。此外，GBM內層粘連蛋白(laminin)α1-α5同時發生代償性合成增多并積聚，使GBM發生改變進而影響鄰近足細胞的黏附，導致足細胞骨架結構異常[16]。另一方面，足細胞表達的Ⅳ型膠原受體α1β1整合素、α2β1整合素、盤狀結構域受體(discoidin domain receptor, DDR)1和DDR2可通過識別GBM中異常Ⅳ型膠原鏈介導足細胞內多種促炎癥因子和促纖維化因子[如TGF-β1、結締組織生長因子、基質金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9等]表達上調進而引起足細胞損傷。②COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變引起的細胞內效應直接導致足細胞損傷。COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變可導致Ⅳ型膠原α3-α4-α5鏈錯誤折疊并在足細胞內聚集，誘導內質網應激和未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，導致足細胞凋亡等細胞損傷。2014年，Pieri等[17]在攜帶COL4A3-G1332E基因錯義突變的患者和小鼠足細胞中均觀察到內質網中滯留的α3突變體，并檢測到UPR激活的相關標志物。

除了TBMN、COL4A3和(或)COL4A4基因突變導致的FSGS外，常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病還包括ADAS。ADAS由Shaw等[18]于1976年首次報道。從現有2個樣本量相對較大的ADAS臨床隊列[19-20]統計結果看，這類ADAS患者發生蛋白尿和ESRD的時間相較由COL4A5基因半合子突變所導致的X連鎖顯性遺傳型AS(X-linked AS，XLAS)和由COL4A3或COL4A4基因純合或復合雜合突變所導致的常染色體隱性遺傳型AS(autosomal recessive AS，ARAS)明顯延遲(蛋白尿和ESRD發生的平均年齡分別為19和70歲)。其中，約24.3%的患者在平均年齡50歲前發生ESRD，合并腎外表現的比例極低，僅4%的患者發生聽力喪失和眼部異常。電鏡研究數據[5]顯示，44%的患者存在基底膜變薄，但無撕裂、分層，僅有少部分患者達到AS的診斷標準。故學者建議，將攜帶COL4A3或COL4A4基因雜合致病突變的患者診斷為常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病[21]。但也有學者認為，應該將所有尿液檢測異常的COL4A3或COL4A4基因雜合突變患者均診斷為ADAS，旨在引起醫師和患者的重視，對疾病進行隨訪和干預，避免腎功能損傷或發生延緩其進展[5]。

2 常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的基因與表型關聯分析

基因診斷對常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的確診、家系內患病親屬的篩查，以及產前診斷至關重要。通過基因診斷及時明確病因有助于對疾病進行針對性治療從而延緩腎功能損傷的進展，避免或減少糖皮質激素和(或)免疫抑制劑的使用。

隨著NGS在臨床應用的普及，越來越多的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變位點被檢出。目前，在人類基因突變數據庫(human gene mutation database, HGMD)[22]和荷蘭萊頓基因突變數據庫(Leiden open variation database, LOVD)[23]中共收錄了近2 000個COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變位點，其中COL4A5基因突變占68%，COL4A3、COL4A4基因突變占32%。上述COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變位點中同時存在于2個或以上獨立家系或患者的比例僅為19%，其他突變位點多為個案報道。此外，通過NGS或其他基因檢測手段，大量COL4A3、COL4A4、COL4A5基因的新發突變和不明意義變異位點(variant of undetermined significance, VUS)還在不斷被發現[24]。除借助生物學信息學分析判斷這些位點的致病性外，還可利用患者自身細胞[25](如提取尿液中足細胞，或將皮膚成纖維細胞誘導為足細胞，或構建類器官等)、體外工具細胞和動物模型開展各項體內、體外功能實驗。美國醫學遺傳學與基因組學學會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)發布的《ACMG遺傳變異分類標準與指南》[26]對新發突變的致病性列出了詳細的判斷標準，以幫助明確COL4A3、COL4A4、COL4A5基因新發突變和VUS位點的致病性分類。

同一基因在不同區域發生不同類型突變可導致輕重不一的臨床表型，即基因型與臨床表型關聯(genotype-phenotype correlation)[27]。目前未發現Ⅳ型膠原相關腎病的熱點突變區域，疾病的基因型與臨床表型的關聯證據主要來自于男性XLAS患者。3項大樣本的研究[28-30]結果顯示，攜帶COL4A5基因大片段重排或缺失或插入、單個堿基突變導致的無義突變或移碼突變或剪接位點突變是較常見的男性XLAS患者與臨床表型關聯的基因型，且患者的臨床表現較重。對于COL4A5基因氨基端非膠原區(7S)、含大量甘氨酸(Glycine，Gly)-X-Y重復結構的膠原區(X、Y代表除Gly外其他氨基酸)和羧基端非膠原區3個結構域內單個堿基突變(如錯義突變、剪接位點或內含子突變、不引起移碼的小片段缺失或插入)是否導致臨床表型和腎臟疾病預后有所差異，目前的觀點尚不一致。2000年，Jais等[28]對攜帶COL4A5基因突變的195個家系的共401例男性患者進行分析，結果提示：攜帶大片段重排、無義突變、移碼突變的患者于30歲之前進展至ESRD的概率均為90%；攜帶剪接位點突變、錯義突變的患者腎損傷相對較輕，30歲前進展至ESRD的概率分別為70%、50%。2002年，Gross等[29]對267例XLAS患者進行的meta分析結果提示：①大片段重排、無義突變、移碼突變、剪接供體位點突變或羧基端非膠原區發生突變患者進展至ESRD的中位年齡為19.8歲；②21～47號外顯子Gly錯義突變、框內突變和涉及剪接受體位點突變患者進展至ESRD的中位年齡為25.7歲；③1～20號外顯子Gly錯義突變患者進展至ESRD的中位年齡為30.1歲。Bekheirnia等[30]于2010年對來自175個家庭的681例男性XLAS患者進行分析，結果提示，攜帶錯義突變、剪接位點突變、截短突變、缺失突變的患者進展至ESRD的中位年齡分別為37、28、25、22歲。

女性XLAS患者發生的X染色體失活(里昂化，lyonization)為根據基因型判斷臨床表型和腎臟預后帶來一定難度[31]。XLAS臨床癥狀的嚴重程度和腎臟預后還與攜帶修飾基因位點的多態性，COL4A3、COL4A4、COL4A5的雙基因或三基因突變，以及合并其他原發或繼發性腎臟病和環境因素等有關[32]。

目前，關于ARAS的基因型與臨床表型相關性尚無定論。據Storey等[33]報道，在ARAS中存在COL4A3、COL4A4基因截短突變的患者腎功能衰竭發生時間較早。然而，Oka等[34]未在ARAS中發現基因型與臨床表型的相關性。

相較XLAS和ARAS，常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的不同家系間，以及同一家系內不同患病親屬間均可出現顯著的臨床異質性[5]。2項樣本量較大的ADAS研究[19-20]均未發現顯著的基因型與臨床表型的關聯。Andreas等[35]對74例進展至ESRD的COL4A3、COL4A4基因雜合突變患者進行meta分析后發現，54例錯義突變的患者進展至ESRD的平均年齡為55.2歲，20例非錯義突變(導致翻譯提前終止的缺失、重復、剪接位點突變)患者進展至ESRD的平均年齡為47.1歲。兩類患者進展至ESRD的年齡差異具有統計學意義。

針對上述局限，最近Kamura等[36]基于納米熒光素酶片段互補技術(split-nanoluciferase binary technology)建立了一種體外實時定量分析Ⅳ型膠原α345三聚體的聚合穩定性的分子診斷新方法。由Ⅳ型膠原α3-α4-α5單鏈在足細胞內互作聚合形成并分泌至胞外的Ⅳ型膠原α345三聚體是構成GBM中Ⅳ型膠原網的核心骨架分子。該研究挑選了9個基因型與臨床表型關聯確鑿且導致臨床表型輕重不一的COL4A5錯義突變基因以驗證該方法的準確性[36]，發現各突變引起的Ⅳ型膠原α345三聚體聚合穩定性改變與臨床表型顯著相關。該團隊還發現，COL4A5基因突變，如G230C，主要引起足細胞內Ⅳ型膠原α345三聚體聚合障礙，攜帶該突變的患者進展至ESRD的平均年齡僅21.5歲，臨床表型較重。主要引起Ⅳ型膠原α345三聚體分泌水平輕度異常而不引起足細胞內Ⅳ型膠原α345三聚體聚合異常的COL4A5基因突變(如G509R、G805R和G1143S)所致的臨床表型較輕，蛋白尿和ESRD發生的時間明顯延遲。致病性目前尚不明確的多態性位點，如G953V，對Ⅳ型膠原α345三聚體聚合穩定性的影響與野生型相比無顯著差異。

3 常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的治療

目前，針對Ⅳ型膠原相關腎病的治療進展主要集中于AS，包括藥物治療、腎臟替代治療、腎移植術、基因和細胞治療。常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病患者如出現尿蛋白增多或腎損傷，以RAAS抑制劑治療為主。對于出現大量蛋白尿或腎病綜合征的患者，則予以糖皮質激素和(或)免疫抑制劑治療。進展至ESRD患者，可行腎臟替代治療或腎移植術。

3.1 RAAS抑制劑 2013年，國際AS專家組發表的診治建議[37]將治療藥物分為一線和二線用藥，其中一線治療應用ACEI，這類藥物包括雷米普利、依那普利等；二線治療應用ARB和醛固酮受體拮抗劑；常用的ARB類藥物包括氯沙坦、厄貝沙坦、纈沙坦等。一項大型回顧性研究[38]結果表明，早期應用ACEI可使AS患者進展至透析的時間延遲13年。2020年，一項名為EARLY PRO-TECT Alport(Early Prospective Therapy European Community Trial Alport)的Ⅲ期臨床試驗[39]結果表明，在AS患兒出現顯性尿蛋白之前使用雷米普利能有效延緩其蛋白尿的進展和腎小球濾過率的下降，使疾病進展的風險降低近一半(風險比為0.52，95%CI： 0.19～1.39)，并且尚未發現安全問題。2017年，首個關于RAAS抑制劑應用于攜帶COL4A3、COL4A4、COL4A5基因雜合突變患者的前瞻性研究[40]結果表明，RAAS抑制劑亦可有效延緩此類患者的腎功能損傷進展。

3.2 糖皮質激素和(或)免疫抑制劑 對于少部分表現為大量蛋白尿或腎病綜合征的TBMN患者,可試用糖皮質激素。據Nogueira等[41]報道，3例表現為重度蛋白尿或腎病綜合征的TBMN患者中有2例接受糖皮質激素治療后蛋白尿緩解或顯著改善。環孢素A(cyclosporine A，CsA) 為鈣調神經蛋白磷酸酶抑制劑，是一種強效免疫抑制劑，可直接改變GBM的通透性，改善腎臟血流動力學，發揮降低尿蛋白的作用。1999年，Callís等[42]報道稱，CsA治療AS可顯著降低尿蛋白水平，并在長期隨訪中顯示出腎臟保護作用。2007年，Charbit等[43]使用CsA治療9 例 AS 患者后發現，患者尿蛋白減少的同時伴有腎小球濾過率降低，并且3例患者在第二療程結束時復查腎活檢均顯示有明顯腎毒性。因此，目前CsA的應用仍存在爭議。COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突變導致的FSGS對免疫抑制劑反應差，治療前進行基因診斷明確致病基因可避免不必要的免疫抑制治療和由其導致的藥物不良反應。

3.3 帶來腎臟獲益的新型治療藥物 新型治療藥物如甲基巴多索酮(bardoxolone methyl)和抗微RNA-21已進入臨床試驗階段。甲基巴多索酮可抑制NF-κB，并誘導核因子E2相關因子(Nrf2)表達，從而發揮抑制炎癥反應，誘導線粒體功能恢復，減少氧化應激的作用。此外，甲基巴多索酮已被證實可提高2型糖尿病合并CKD患者的腎小球濾過率[44]，但其安全性尚存爭議。盡管甲基巴多索酮可提高腎小球濾過率，但同時可能會伴隨高濾過狀態和腎小球高壓，后者會損傷GBM，并提高尿白蛋白/肌酐比值[45]。此外，一項關于2型糖尿病合并CKD4期患者的臨床研究[46]發現，與安慰劑組(1 097例)中的55例相比，甲基巴多索酮組(1 088例)共有96例患者因心力衰竭住院或死亡(風險比為1.83，95%CI： 1.32～2.55，P<0.001)。目前，一項關于甲基巴多索酮治療AS的有效性和安全性的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗已啟動(臨床試驗編號：NCT03019185)。但仍需更多臨床研究以指導甲基多巴索酮的應用。微RNA-21參與包括腎臟在內的多個器官的纖維化與損傷后組織修復的調節。2015年，Gomez等[47]在AS小鼠模型中發現，抗微RNA-21藥物可通過刺激代謝途徑阻止AS的進展，改善AS小鼠的腎臟病理損害和腎功能，使患有持續進展性腎病的小鼠中位生存時間延長>40%。目前，一項關于SAR339375(抗微RNA-21藥物)治療AS的Ⅱ期臨床試驗正在進行中(臨床試驗編號：NCT02855268)。

4 常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的遺傳咨詢

臨床醫師應注重對常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病患者進行遺傳咨詢(遺傳概率為50%)，避免近親婚配，盡可能優生、優育。對于家系中有生育意愿者可進行產前診斷，如進行胎盤植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)，以選擇遺傳學健康的胚胎用于移植，阻斷子代遺傳，提高人口素質。

5 總結與展望

由COL4A3或COL4A4基因雜合突變所導致的常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病是根據疾病發病機制而命名的新概念，其疾病譜包括COL4A3或COL4A4基因雜合突變引起的TBMN、FSGS和ADAS。常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病在CKD人群中的比例約占0.3%～1%，重視該病的早期診斷對CKD防治具有重要意義。常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病的臨床表型異質性強，多數患者可進展至ESRD，可能與患者所攜帶的基因型、合并其他腎臟疾病或影響腎功能進展的危險因素等有關。近年來，在藥物治療AS的臨床研究領域有較多進展，其研究結果可否運用于常染色體顯性遺傳Ⅳ型膠原相關腎病有待后續研究明確。