基于羅丹明B熒光猝滅構建食用油脂過氧化值檢測模型

李靜雅 白 瑩 薛林科 張小林

(甘肅醫學院,平涼 744000)

油脂是日常飲食三大產能營養素之一[1]，過氧化值反映了油脂變質程度[2]。目前過氧化值的檢測方法很多,主要有碘量法[3-6]、光度法[7-8]，紅外光譜法[9]、色譜法[10]、電化學分析法[11]等。碘量法采用氧化-還原滴定法,是油脂過氧化值國標通用分析方法[12]，受溶液pH值、溫度、加水量及搖動速度、滴定終點判斷等諸多因素影響,使得測定值波動性大,重復性差；同時,該法取樣量大,僅適用于含0.4 mmol/kg以上過氧化物的測定，靈敏度低，很難做到微量分析。熒光光譜技術因其靈敏度高,選擇性強,試樣用量少等優點被關注，Santas等[12]以二苯基-1-芘基膦試劑為熒光探針，完成食用油脂過氧化值熒光光譜檢測，測定了43個樣品的過氧化值(0～15 mmol/kg)；Guzmán等[13]利用熒光光譜結合多變量分析技術研究了橄欖油的各種質量參數，為測定油脂的過氧化值提供了又一個有效的方法。

羅丹明B(Rhodamine B，RhB)俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，稀釋液有強烈熒光，可溶性碘(I3-)與其有締合反應[14-16]。油脂中過氧化物與過量碘化鉀(I-)反應生成水溶性碘(I3-),締合反應使其熒光猝滅，熒光猝滅程度取決于油脂中過氧化物含量。本實驗研究了有過氧化物存在時KI-RhB體系的熒光光譜特性，提出了用羅丹明B染料熒光猝滅法測定油脂過氧化值的新方法。羅丹明B熒光猝滅法簡便快捷，靈敏度高，過氧化物最低檢出量達到0.06 mmol/kg，更適合于油脂過氧化值微量分析。通過油脂空白試驗，有效克服了共存還原性物質及有機溶劑的干擾，測定過程不受樣品濁度和色度影響，方法的選擇性進一步提高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

930N熒光分光光度計。

30%H2O2、羅丹明B、醋酸、醋酸鈉、冰醋酸、碘化鉀、三氯甲烷：分析純。

1.2 溶液配制

H2O2對照液：取25 mL的30%H2O2稀釋成250 mL,KMnO4標定，根據標定值二次稀釋為1 mmol/L；羅丹明B溶液∶1.0×10-4mol/L；飽和碘化鉀溶液:稱取14 g碘化鉀,加10 mL水溶解；三氯甲烷-冰乙酸混合液(2∶3)，混勻；0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH4.5)。食用植物油作分析樣品，均來自當地超市。

1.3 方法原理與量值追溯

油脂中的過氧化物與碘化鉀定量反應生成碘單質(I2)

ROOH(過氧化物)+2HI→H2O+I2+ROH

過量碘化鉀作助溶劑形成可溶性碘(I3-)：

I2+I-=I3-

在弱酸環境下，I3-與羅丹明B陽離子通過靜電引力形成締合物，締合反應導致羅丹明B熒光猝滅，猝滅程度決定過氧化物含量。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣液制備

稱取3～5 g油脂樣品(精確到0.000 1 g)于25 mL容量瓶，用三氯甲烷-冰乙酸混合溶劑(2∶3)溶解并稀釋定容，取樣前再次充分振蕩。

1.4.2 樣品測定

準確移取100 μL樣液于50 mL容量瓶中，加飽和KI溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置反應25 min，加1.00×10-4mol/L羅丹明B 4.00 mL，0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)5.00 mL，蒸餾水定容，靜置20 min，以365 nm作激發波長，580 nm作發射波長，1.0×10-6mol/L羅丹明B作為靈敏度調試液，測定熒光強度F。同時完成油脂空白試驗(不加KI)F0測定，根據熒光猝滅程度ΔF(ΔF=F0-F)確定油脂過氧化值。

注：X為過氧化值/mmol/kg；k為方程斜率(k=7 598L/mmol)；m為油脂樣品質量/g。

1.4.3 過程比較

碘量法與熒光猝滅法過程比較見表1。

表1 兩種方法測定過程比較

2 結果與討論

2.1 熒光光譜與模型方程

當λex=365 nm時，羅丹明B在580 nm處有一最大熒光峰(圖1曲線1)，加入過量KI時，羅丹明B熒光值不受影響，加入H2O2后，I-被氧化為I3-，羅丹明B與I3-締合反應導致熒光猝滅，熒光強度迅速下降(圖1曲線2)；熒光猝滅程度隨H2O2濃度增大而增強(圖1曲線3)。

注：1.RhB+I-,2.RhB+I-+H2O2(0.005mmol/L),3.RhB+I-+H2O2(0.018mmol/L)。圖1 不同體系的熒光光譜

取1 mmol/L H2O2對照液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL，再分別加入0.10 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，以此代替油脂樣品，按方法完成F和F0測定，計算ΔF，以濃度c(mmol/L)為橫坐標，ΔF為縱坐標，繪制H2O2標準曲線，構建油脂過氧化值模型方程。結果表明，在0.000～0.024 mmol/L范圍內，H2O2濃度c與熒光強度變化值ΔF有良好的線性關系：ΔF=7 598c-0.892 7，r=0.998 9，按實驗方法平行測定H2O2空白11次，標準偏差s為0.012，3倍的信噪比求得過氧化氫檢測限為4.74×10-6mmol/L，當取0.02 g油樣稀釋時，得出油脂過氧化值最低檢出量為0.06 mmol/kg。試驗選擇以365 nm作為激發波長，檢測580 nm發射波長處溶液的熒光強度。

2.2 羅丹明B用量優化

在pH 4.5環境下考察不同體積羅丹明B溶液的熒光特性。結果表明，在0～4 mL范圍內羅丹明B稀釋液熒光強度與1.0×10-4mol/L羅丹明B加入體積有線性關系，當稀釋液中c(RhB)≥8.0×10-6mol/L時，V(RhB)>4mL，熒光強度趨于恒定，羅丹明B分子間發生了聚合[18]。故1.0×10-4mol/L羅丹明B取量確定為4.00 mL。

2.3 溶液pH的影響

取1 mmol/L H2O22.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸改變反應體系pH值，測定pH2～6范圍內“H2O2+I-+RhB”體系熒光強度。結果表明，pH=4.0～5.0時，猝滅程度最大，熒光強度達到最低。H2O2是含氧型氧化劑，半反應有H+參與，但酸度過高時，部分H2O2發生分解。故實驗選用pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作反應介質。

2.4 飽和KI溶液添加量

KI有雙重功效，既是還原劑，又是助溶劑，為促進碘合離子(I3-)形成，加大羅丹明B熒光猝滅程度；碘化鉀加入量過少會使反應不充分，測定結果偏小，影響結果的準確性；過多則會因碘化鉀空氣氧化產生誤差。取1 mmol/L H2O2對照液2.00 mL，其他條件不變，僅改變飽和碘化鉀溶液加入量，按“1.4”測定方法完成F測定。結果表明，當飽和碘化鉀的添加量超過0.4 mL后,即使碘化鉀的添加量增加,溶液的熒光強度依然趨向穩定值,說明此時碘化鉀的添加量已經能夠滿足反應需求,因此確定飽和碘化鉀的添加量為0.5 mL。

2.5 反應時間影響

碘化鉀與油樣中過氧化物的反應時間決定了油樣中過氧化物能否完全反應，反應時間過長或過短都可在一定程度上影響試驗結果的準確性。取1 mmol/L H2O2標準溶液2.00 mL，其他條件不變，僅改變加入碘化鉀后的靜置反應時間，按“1.4”測定方法完成F測定，不同反應時間的溶液熒光強度變化情況如圖2所示。

圖2 氧化反應時間影響

過氧化物與碘化鉀混合時間直接決定了熒光猝滅程度，反應進行25 min后，溶液熒光強度隨反應時間變化不大,趨近一個穩定值,說明此時過氧化物已經和碘化鉀反應較為充分,繼續延長反應時間也不能使溶液熒光強度有較大的變化,因此反應時間定為25 min。

實驗同時考察締合反應時間對體系熒光強度的影響(圖3)。結果表明，加入羅丹明B后，熒光強度隨靜置時間延長而減小，20 min后熒光強度趨于恒定。故加羅丹明B后靜置時間確定為20 min。

圖3 熒光猝滅反應時間影響

2.6 樣品分析

取不同植物油樣品，按“1.4”方法完成過氧化值測定，并與碘量法作比較，測定結果見表2。

表2 樣品分析結果(n=6)

利用所建方法對不同待測油樣過氧化值進行了6次平行測定,相對標準偏差(RSD)控制在2.8%范圍內，測定結果與碘量法基本一致，測量誤差小于5%。

3 結論

本實驗基于“H2O2-I--RhB”反應體系建立了油脂過氧化值檢測模型，油脂加入前后熒光強度變化量(ΔF)體現了油脂過氧化值，方法簡單且具有很好的靈敏度，用于油脂過氧化值微量檢測，最低檢出量為0.06 mmol/kg；碘化鉀空白實驗有效克服有機溶劑及油脂中共存還原性物質干擾。