雞傳染性支氣管炎病毒分離鑒定及S1基因遺傳演化分析

曹祁峰，任顯東，李閣錦，李冰*

(1. 錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧 錦州 121001；2. 錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧 錦州 121001)

雞傳染性支氣管炎(chicken infectious bronchitis)是由冠狀病毒科、γ冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(infections bronchitis virus，IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病主要侵害呼吸系統、消化道和泌尿生殖系統，是危害世界養禽業的傳染病之一[1]。冠狀病毒僅感染脊椎動物，主要引起人和動物的腸道及呼吸道疾病[2]。21世紀以來暴發的嚴重急性呼吸綜合征和中東呼吸綜合征以及新型冠狀病毒肺炎，使得該類病毒備受人們關注[3]。冠狀病毒可分為4個屬：α、β、γ、δ。α和β冠狀病毒主要為哺乳動物病毒，γ冠狀病毒主要包括IBV、火雞冠狀病毒、白鯨冠狀病毒及其他禽類物種中分離到的冠狀病毒，其中造成嚴重經濟損失的γ屬冠狀病毒主要為IBV與火雞冠狀病毒[4-5]。IBV是第一個被發現的冠狀病毒，于1930年在美國NorthDakota首次被分離；1931年Beaudette和Hudson首次對該病毒進行文字報道；1956年Jungherr等利用中和試驗證實IBV存在多個血清型，且不同血清型之間沒有交叉保護。1972年鄺榮祿等首次報道我國廣東省存在IBV，隨后雞傳染性支氣管炎在我國廣泛流行，每年對我國養禽業造成巨大經濟損失。

IBV屬于單股正鏈、含囊膜的RNA病毒，其核酸長度約為27.6 kb，編碼纖突(S)蛋白、膜(M)蛋白、小包膜(E)蛋白和核(N)蛋白4種結構蛋白和15個非結構蛋白(nsp2～16)，其中S蛋白是位于病毒粒子囊膜上的棒狀纖突結構，具有十分重要的生物學功能[6]。IBV的S蛋白存在堿性氨基酸裂解位點，通常是由RRXRR/S(X為任意氨基酸)或HRRRR組成，成熟的S蛋白可以被宿主細胞的弗林蛋白酶切割成S1和S2亞基[7]。S1蛋白是中和抗體的主要誘導蛋白，能夠誘導機體產生中和抗體、血凝抑制抗體，對IBV的感染性、致病性、組織嗜性及細胞嗜性起決定作用，也是決定IBV血清型的主要蛋白，因此S1基因核苷酸序列是IBV分離株分型的重要依據[8]。本研究通過對疑似病例進行病毒的分離鑒定，并對S1基因進行測序分析，初步明確了遼寧分離株遺傳演化特點，為遼寧地區雞傳染性支氣管炎的防控和疫苗的選擇提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及試驗動物

錦州某雞場3只疑似傳染性支氣管炎瀕死肉雞的腎臟病料樣品，由錦州市動物疫病預防控制中心提供；10日齡雞胚、14日齡未免疫雛雞，均購于錦州鴻強牧業有限公司。

1.1.2 主要試劑

雞新城疫活疫苗(La Sota株)，購自山東綠都生物科技有限公司；TRIzol試劑，購自深圳市康初源有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；Millipore超濾管，購自北京強欣博瑞生物技術有限公司；pMD18-T載體、DNA連接酶、大腸桿菌DH5α感受態細胞，均購自大連TaKaRa公司。Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病料的檢測

將臨床無菌采集的疑似IBV感染病料剪碎，與無菌PBS 1∶5倍混合并研磨，研磨液反復凍融3次，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，將樣品分為2份，一份置于-80 ℃冰箱保存，另一份按照TRIzol試劑方法提取病毒總RNA。參照Nguyen等[9]建立的針對N基因的RT-PCR方法進行IBV檢測。上游引物5′-TG-GGTGACTCAATTCTGCTGTTGGACGTGTVCCTACACCA-3′,下游引物5′-GTCTACCAGGCATTCGCTTCCAGGAYCAGCARAAGAAGG-3′，產物片段大小386 bp。反應體系為：1 μL上游引物、1 μL下游引物、3 μL cDNA、9 μL MixTaq酶、6 μL ddH2O。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后于72 ℃延伸10 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用PCR方法進行新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV H5、H7、H9)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽腺病毒(FAdV)等病原檢測[10-13]。

1.2.2 病毒的增殖與EID50的測定

將上述檢測IBV陽性樣品經0.22 μm濾膜過濾后，加入雙抗置于4 ℃冰箱1 h后， 10日齡雞胚尿囊腔接種，0.3 mL/個，每次接種6枚雞胚，并設置生理鹽水對照組，置37 ℃孵化器孵化，棄去24 h內死亡雞胚，72 h統一收胚，盲傳5代，回收尿囊液置于-80 ℃冰箱保存。取45枚10日齡雞胚，使用無菌PBS對第5代病毒液進行稀釋，分別稀釋至10-1～10-8，雞胚尿囊腔接毒，每個梯度接種5枚雞胚，0.1 mL/個，對照組接種等劑量的無菌生理鹽水，37 ℃恒溫孵育，每天照蛋2次，棄去24 h內死亡雞胚，144 h后統一收胚，根據24～144 h雞胚死亡情況及活胚有無發育受阻等特異性癥狀進行綜合評估，利用Reed-Muench方法計算EID50。

1.2.3 病毒純化與血凝試驗

取第5代雞胚尿囊液，12 000 r/min離心5 min，取上清經0.22 μm濾膜過濾后，參照Millipore 超濾管使用說明對病毒液進行純化，純化后置于-80 ℃冰箱保存備用，取2 mL純化病毒液,將其分為A、B組，1 mL/組，A組加入等體積終濃度為3%的胰酶，37 ℃水浴3 h，每15 min震蕩1次，消化結束后加入1%胎牛血清終止胰酶作用；B組病毒液不處理，進行血凝試驗，測定血凝效價。

1.2.4 新城疫病毒抑制試驗

將30枚10日齡雞胚分為3組，10個/組進行尿囊腔接種。A組單獨接種新城疫La Sota株疫苗；B組先接種0.2 mL第5代尿囊液，12 h后再接種等劑量的新城疫La Sota株疫苗；C組接種生理鹽水作為對照組，37 ℃恒溫培養72 h。按常規方法測試各組血凝滴度。

1.2.5 S1基因克隆與測序

參照GenBank中公布的雞傳染性支氣管炎QXIBV毒株(NO.MN548289)的S1基因組序列設計特異性引物：上游引物5′-AAGAAGGAACAAAAGACCGACT-3′，下游引物5′-CAAAAWCTGCCATAACTAACATA-3′。按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書從第5代尿囊液中提取總RNA，按常規方法進行反轉錄，采用PCR方法擴增S1基因序列，退火溫度53 ℃，產物片段大小1 735 bp。按照膠回收試劑盒操作說明進行目的條帶回收，將目的基因連接pMD18-T載體，連接產物轉化DH5α感受態細胞。挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜。用質粒小提試劑盒提取質粒，經PCR檢驗，陽性重組質粒送生工生物工程股份公司測序，為了確保全基因序列的準確性，每個陽性質粒測序3次。

1.2.6 S1基因序列遺傳進化分析

以GenBank數據庫中的IBV傳統疫苗株、流行毒株和國內外部分經典毒株作為本次研究的參考毒株，利用DNAStar 7.1軟件中MegAlign程序的ClustalW方法進行序列比對及核苷核序列和氨基酸序列的同源性分析。參考文獻[14]中基于IBV S1基因的分型方法，采用MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining方法構建基于S1基因序列的系統發育進化樹。

1.2.7 動物回歸試驗

將40只14日齡未免疫健康雞平均分為2組，攻毒組和對照組，分別飼養于隔離飼養器內。攻毒組使用分離株CH/LN/2019進行滴鼻、點眼，接種劑量為0.2 mL；對照組以同等劑量的生理鹽水進行滴鼻、點眼，分別置隔離器中飼喂21 d。攻毒后每天觀察雞只的精神狀態、食欲以及呼吸道是否出現臨床癥狀，對死亡雞只進行剖檢。計算發病率和死亡率。

2 結果與分析

2.1 病料檢測

利用IBV的N基因特異性檢測引物分別對3份病料處理樣品進行RT-PCR檢測，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，均見約386 bp的目的條帶(見圖1)，與預期片段大小一致，證明3份病料樣品中存在IBV。經PCR鑒定未檢測到NDV、AIV、IBDV、ALV和FAdV(見圖2)。

M.DL2000 Marker;1～3. 疑似IBV病料;4. 陰性對照

M.DL2000 Marker;1. 陽性對照;2. 陰性對照;3. 待測樣品

2.2 雞胚發育情況和EID50的測定

病毒液在10日齡雞胚尿囊腔接種后，傳至第3代時，雞胚發育明顯受到病毒抑制，出現死胚、侏儒胚等現象。胚體自氣室取出后，可觀察到胚體蜷縮，雙腳抱頭，羊膜增厚與胚體粘連，胚體體積明顯小于對照組。雞胚半數感染量測定時，根據雞胚病變情況與數量，采用Reed-Muench方法計算，分離株CH/LN/2019的EID50為105.66/0.1 mL。

2.3 血凝試驗

A組病毒液經3%胰酶處理后，可凝集雞紅細胞，血凝效價平均為26；B組未經處理胰酶的病毒液，對雞紅細胞無凝集作用，證明該病毒液內無具有血凝特性的外源性病毒。

2.4 新城疫抑制試驗

單獨接種新城疫La Sota株疫苗的雞胚尿囊液血凝效價平均為27。先接種第5代尿囊液，再接種新城疫La Sota株疫苗的血凝效價平均為23。生理鹽水對照組無血凝特性。說明該分離株能抑制新城疫病毒在雞胚內的增殖，符合IBV特性。

2.5 S1基因克隆與測序

采用本研究設計的S1基因特異性引物對第5代尿囊液進行RT-PCR擴增，所得目的片段與預期片段大小一致(見圖3)。經測序確定遼寧分離株S1基因核苷酸長度為1 620 nt，基因序列已上傳至GenBank數據庫，登錄號為MT292303，并將該分離毒株命名為CH/LN/2019。

M.DL2000 Marker;1. 第5代尿囊液;2. 陰性對照

2.6 S1基因遺傳演化、同源性分析與裂解位點分析

根據IBV S1基因序列繪制遺傳進化樹，結果顯示(圖4)，分離株CH/LN/2019與參考毒株形成8個不同的進化分支(基因型)，分別為CHⅠ～CHⅥ 型、Gray型和Mass型，分離株CH/LN/2019與CHⅠ型親緣關系最近。通過同源性對比發現，分離株CH/LN/2019與國內的常規疫苗株H120、H52和MA5等核苷酸和氨基酸序列同源性分別為77.2%～76.9%和75.4%～76.2%；與CHⅠ型代表毒株QXIBV株核苷酸和氨基酸同源性分別為95.6%和94.8%；與基因Ⅱ型代表毒株4/91株核苷酸和氨基酸同源性分別為76.6%和78.3%。因此，可判定該分離株屬于以QXIBV株為代表的CHⅠ型(QX型)毒株。測序結果顯示，分離株CH/LN/2019 S1基因全長為1 620 nt，編碼540個氨基酸。根據推導的氨基酸序列顯示，分離株的S1基因裂解位點為HRRRR，與CHⅠ型分支的所有參考毒株裂解位點一致，而疫苗株H120 S1基因長度為1 611 nt，編碼537個氨基酸。這表明分離株CH/LN/2019的核苷酸存在基因插入和缺失的現象。利用DNAStar中的Megalign軟件對分離株CH/LN/2019與疫苗株H120核苷酸序列進行比對，結果顯示，分離株CH/LN/2019分別在66～68、358～360和365～367位點插入了核苷酸TTC、ACA、TCT，因此推導其氨基酸序列差別較大。

2.7 動物回歸試驗

人工感染CH/LN/2019毒株后，第3天攻毒組出現甩頭、口鼻流出漿液性黏液，第7～9 天出現閉目、呆立、羽毛蓬亂、張口呼吸、飲水顯著增加、排白色稀糞，第10天開始出現死亡，第16 天癥狀轉歸，第20天雞只恢復正常。剖檢病死雞只均呈現典型“花斑腎”現象，輸尿管內有大量尿酸鹽沉積，氣管輕度出血并附著漿液性黏液，法氏囊腫大。攻毒組發病率100%，病死率為50%，對照組未出現癥狀與死亡。

3 討論

IBV的S蛋白是最重要的保護性抗原，同時也是變異最大的蛋白，S蛋白的抗原位點和高變區主要集中在S1蛋白上，當S1蛋白發生基因缺失、插入、片段重組或點突變時會導致新的血清型和基因型出現和流行[15]。本研究通過臨床病料分離到1株IBV，并命名為CH/LN/2019?；赟1基因核苷酸以及推導的氨基酸序列遺傳演化分析，分離株CH/LN/2019與CH Ⅰ 型(QX型)的代表毒株同源性最高，分別為95.6%和94.8%，且具有相同的HRRRR裂解位點特征。IBV的S1蛋白是中和抗體的主要誘導蛋白，其含有3個高變區(HVRs)，分別位于38～67、91～141和274～387位氨基酸，含有特異性抗原中和表位[16]。相較于國內常規疫苗株H120，分離株CH/LN/2019的S1基因在位于高變區的121、122位分別插入了氨基酸G和S，這些插入是導致分離株與疫苗株ORF長度不同的主要原因。有研究表明IBV的S1基因在第269～298位氨基酸存在1處強親水區[17]，對比疫苗株H120，分離株在該區域出現大量氨基酸替換現象，說明該位置已經出現了基因變異，這一點可能會影響IBV血清型及毒力的強弱。HVRs區域內的核苷酸或氨基酸出現突變或位置改變時，都可能產生1個新的變異毒株，此外S1蛋白與IBV的組織嗜性有關[18-19]。但該分離株CH/LN/2019是否出現組織嗜性的改變有待進一步研究。

▲為分離株;◇為疫苗株

IBV的基因分型主要聚焦于S1基因，分析S1基因序列有助于了解該地區IBV流行趨勢。Luo等[14]對2009—2010年國內不同地區的38株野外毒株進行S1基因遺傳進化分析，將IBV劃分為分為7個基因型，分別為MASS型、CHⅠ(QX型)～CHⅥ型。趙燁[20]對國內近20年IBV分型統計結果顯示，我國每年70%以上的IBV病例都是由QX型引起。陳良珂等[21]對2013—2017分離的390株IBV進行S1基因序列遺傳進化分析結果表明，QX型是我國目前主要的優勢基因型，另外CHⅤ型比例也在逐年上升。CHⅡ型與CHⅥ 型病毒在中國IBV分離株中所占比例相對穩定(約占總分離株的15%)，CHⅢ型與CH Ⅳ型病毒所占比例較低且呈逐年下降趨勢[22]。本研究于2019年在遼寧地區分離得到了IBV CH/LN/2019株，參照Luo等[14]基于S1基因的分型方法，確定該分離株屬于QX基因型。由于QX型毒株與國內當前廣泛使用的MASS型疫苗親緣關系較遠，從而導致雞群免疫后仍不能完全抵御IBV流行毒株的侵襲[23]。我國臨床上針對該基因型已研制出雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯活疫苗(La Sota株+QXL87株)，該疫苗針對當前QX型流行毒株可產生高達80%以上的免疫保護率[24]。建議各地區在防控雞傳染性支氣管炎時，應根據當地流行毒株類型選擇適合本地的疫苗，有助于提高疫苗的免疫保護率。