豬傳染性胸膜肺炎與豬肺疫二聯亞單位疫苗的免疫效果評價

姚景麗，武靜橋，范真瑋，李丹，藍肇煜，王小月，趙微，陳婷，何敬文，金天明

(天津農學院動物科學與動物醫學學院/天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384)

由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae, APP)引起的豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)和多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocide，Pm)引起的豬萎縮性鼻炎(porcine infectious atrophic rhinitic，AR)以及豬肺疫(swine pneumonic pasteurellosis)是豬場常見的呼吸道傳染病，常呈混合感染。2種細菌性疾病均通過外源感染，通常經分泌物、排泄物，也可通過被病原菌污染的車輛、器具以及飼養人員的衣物等間接接觸傳播，小嚙齒類動物和鳥也可能傳播本病[1-2]。因此，有效的疫苗接種是防控豬肺疫與傳染性胸膜肺炎的主要手段，二聯疫苗的研發具有現實必要性。

菌影是一種不含核酸、核糖體等內部其他組分的細菌空殼，通過噬菌體phiX174裂解基因E的表達使細菌的細胞內膜和外膜發生融合，形成直徑為40～400 nm的特異性跨膜孔道結構，胞質內容物在滲透壓的作用下由此孔道排出而形成[3]。E基因表達的過程保留了細菌的表面抗原成分和結構，能夠對有機體產生體液免疫、細胞免疫以及局部的黏膜免疫應答[4]。同時細菌菌影具有裝載單一抗原或不同抗原復合物、毒力不反強的特點，可利用菌影作為新型疫苗和遞送載體[5]。

巴氏桿菌OmpH作為菌體外膜蛋白的一種，可有效誘導動物產生特異抗體，從而發揮免疫保護作用。本課題組在前期試驗中，將巴氏桿菌外膜蛋白OmpH質粒導入APP菌影，以APP菌影為載體制備二聯亞單位疫苗。在菌影介導下，OmpH在抗原提呈細胞中表達并提呈，進一步增強了OmpH抗原誘發免疫反應的能力。此二聯疫苗在小鼠試驗中，免疫后誘導機體產生的抗體滴度均高于單一疫苗，二聯疫苗對小鼠的APP I型活菌攻毒的保護效率為100%，對Pm D型活菌的攻毒保護效率為90%[6]。為了進一步驗證二聯疫苗免疫保護效果，本課題組在天津市某規模豬場選取30頭4周齡仔豬進行疫苗免疫效果評估試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌影與質粒來源

APP菌影、OmpH質粒由本實驗室制備。

1.1.2 試驗動物

天津市某規模豬場4周齡仔豬30頭。

1.1.3 試劑

EILSA試劑盒，購自江蘇酶免實業有限公司；FITC標記大鼠CD3+、APC標記大鼠CD4+、PE標記大鼠CD8+抗體、紅細胞裂解液，購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 APP裝載OmpH質粒油乳疫苗制備

將APP菌影、OmpH質粒、APP菌影裝載OmpH質粒3種疫苗原液進行凍干，分別將3種凍干質粒用純化水復溶，使APP菌影溶液濃度為1.4×109CFU/mL、OmpH質粒溶液濃度為625 μg/μL，等比例將上述2種質粒混合，制備APP菌影裝載OmpH質粒二聯苗，開啟高剪切機對以上3種疫苗進行分散乳化5 min。

1.2.2 試驗分組

將30頭4周齡(w)仔豬隨機分為APP組(接種APP疫苗)、OmpH組(接種OmpH疫苗)、APP+OmpH組(接種APP+OmpH二聯苗)和安全試驗組，其中前3組每組7頭，安全試驗組9頭。

1.2.3 安全性試驗

將制備的3種疫苗分別接種安全試驗組仔豬，每種疫苗接種3頭，4 mL/頭，肌肉注射，2 d內觀察有無異常變化。

1.2.4 免疫及采血時間

首免前，APP組、OmpH組、APP+OmpH組分別隨機選取4頭仔豬采血(分別采取抗凝血與非抗凝血)，作為試驗對照組；采血后同日對3組試驗組仔豬分別肌肉注射疫苗(2 mL/頭)進行首免；首免2周后(6 w)進行采血(同上)，采血后同日進行二免(方法同首免)，二免3周后(9 w)采血。

1.2.5 流式細胞術試驗

1.2.5.1 淋巴細胞提取與染色

將新鮮全血加入3倍體積的紅細胞裂解液混勻，冰上靜置15 min，待紅細胞充分裂解后，收集白細胞，反復加入裂解液混勻重懸，提取淋巴細胞。依照流式抗體染色說明書進行，將所用抗體對細胞進行染色。

1.2.5.2 流式細胞儀檢測與數據分析

根據流式抗體染色配色特點，進行儀器調試。使用FlowJo軟件進行分析，首先圈出淋巴細胞，CD3+細胞以其占所圈淋巴細胞的百分比計算[7]，CD4+、CD8+細胞分別以其占CD3+細胞的百分比計算[8]。

1.2.6 ELISA檢測

采血后，常溫靜置30 min，3 000 r/min，離心5 min，取淡黃色血清，并標記。依照ELISA試劑盒操作說明書，進行樣品稀釋、加樣、孵育、洗滌、加酶標二抗、洗滌、再孵育、加顯色劑、加終止液及酶標儀讀數等步驟進行試驗。

1.2.7 血液常規、血液生試驗

取抗凝，用血液分析儀、生化分析儀進行分析。

1.2.8 統計與分析

試驗數據用SPSS軟件進行t檢驗、方差分析。數據用“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 流式細胞術分析免疫細胞水平

2.1.1 疫苗免疫后CD3+細胞占淋巴細胞百分比變化情況

由圖1可見，3種疫苗免疫后外周血中CD3+細胞均呈上升趨勢，二免后(9 w)APP+OmpH二聯苗組所產生的CD3+細胞比例極顯著高于免前對照組(4 w)(P<0.01)，且極顯著高于APP組與OmpH組(P<0.01)。同時，APP與OmpH組的CD3+細胞比例上升差異顯著(P<0.05)，APP組CD3+細胞比例高于OmpH組。

2.1.2 疫苗免疫后CD4+細胞、CD8+細胞占淋巴細胞百分比變化情況

由圖1、圖2、圖3所示，3種疫苗首免后(6 w)，CD4+細胞占淋巴細胞比例均呈上升趨勢，APP+OmpH二聯苗組CD4+細胞上升比例極顯著高于APP與OmpH組(P<0.01)，APP組CD4+細胞上升比例高于OmpH組(P<0.05)；二免后(9 w)3種疫苗免疫后CD4+細胞均呈下降趨勢，APP與OmpH組下降比例高于APP+OmpH二聯苗組；二免后CD8+細胞較一免出現極顯著升高(P<0.01)，且APP+OmpH二聯苗組CD8+細胞升高比例極顯著高于APP與OmpH組(P<0.01)，APP組CD8+細胞升高比例高于OmpH組(P<0.05)。

2.1.3 疫苗免疫后CD4+細胞、CD8+細胞占CD3+細胞百分比變化情況

由圖1、圖4可見，3種疫苗經首免和二免后，CD8+細胞占CD3+細胞比例整體呈上升趨勢，且二免后極顯著升高(P<0.01)，與CD8+細胞占總淋巴細胞比例情況相符；CD4+細胞占CD3+細胞比例情況，3種疫苗首免后整體體呈上升趨勢，二免后整體下降，與CD4+細胞占總淋巴細胞比例情況相符。

*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同

圖2 CD4+細胞占淋巴細胞比例

圖3 CD8+細胞占淋巴細胞比例

Q1. CD8+細胞；Q2. CD8+、CD4+細胞；Q3. CD4+細胞；Q4. CD8+、CD4+細胞

2.2 ELISA檢測抗體水平

2.2.1 APP疫苗和APP+OmpH二聯疫苗免疫后對仔豬APP抗體的影響

APP抗體量增長情況如圖5所示，首免后(6 w)APP組與APP+ OmpH聯苗組較免前(4 w)組仔豬抗體量出現極顯著增高(P<0.01)，且APP+ OmpH聯苗組抗體量增長極顯著高于APP(P<0.01)；二免后(9 w)，APP組抗體量較首免上升極顯著(P<0.01)，APP+ OmpH聯苗組顯著高于APP組抗體量(P<0.05)，APP+ OmpH聯苗組抗體增長率為60.31%。

2.2.2 OmpH疫苗和APP+OmpH二聯苗免疫后對仔豬OmpH抗體的影響

OmpH抗體量增長情況如圖6所示，首免后(6 w)，OmpH組抗體量較免前(4 w)未出現顯著高(P>0.05)，APP+OmpH聯苗組抗體量出現顯著增高(P<0.05)，兩者組間比較，抗體增加量差異極顯著(P<0.01)；二免后(9 w)，OmpH組、APP+OmpH聯苗組抗體均顯著增高(P<0.05)，二免后APP+OmpH聯苗組抗體量仍顯著高于單苗(P<0.05)，抗體增長率為13.42%。

圖5 APP抗體變化

2.3 血常規試驗

2.3.1 3種疫苗免疫后對仔豬白細胞的影響

由表1可見，3種疫苗在首免、二免后，白細胞數顯著高于免前(4 w)(P<0.05)；首免后(6 w)，3種疫苗組間白細胞數變化不明顯(P>0.05)；二免后(9 w)，APP+OmpH聯苗組白細胞數量較APP單苗組、OmpH單苗組顯著增高(P<0.05)，2種單苗組間白細增加數差異不顯著(P>0.05)。

圖6 OmpH抗體變化

表1 疫苗免疫后對白細胞的影響 ×109個/L

2.3.2 3種疫苗免疫后對仔豬淋巴細胞的影響

由表2可見，3種疫苗二免后，淋巴細胞較首免(6 w)顯著增高(P<0.05)，首免(6 w)較免前(4 w)無顯著變化(P>0.05)。3種疫苗組間淋巴細胞數變化不顯著(P>0.05)，但淋巴細胞數量整體呈上升趨勢。二免后，APP+OmpH聯苗組淋巴細胞數增加較多，但無顯著差異(P>0.05)。

表2 疫苗免疫后對淋巴細胞的影響 ×109個/L

2.3.3 3種疫苗免疫后對仔豬中性粒細胞的影響

由表3可見3種疫苗免疫后中性粒細胞數整體呈增加趨勢，3種疫苗首免后(6 w)中性粒細胞極顯著增高(P<0.05)，二免后(6w)無顯著增高(P>0.05)，其中APP+OmpH聯苗組中性粒細胞數在首免、二免后較APP、OmpH組均增加較多，但組間無顯著差異(P>0.05)。

表3 疫苗免疫后對中性粒細胞的影響 ×109個/L

2.3.4 3種疫苗免疫后對仔豬中性粒細胞的影響

由表4可見，4種疫苗免疫后單核細胞整體呈增長趨勢，且首免(6 w)、二免(9 w)后，均出現顯著增多(P<0.05)。首免后，組間中性粒細胞數無明差異(P>0.05)。二免后，APP+OmpH聯苗組中性粒細胞數較2個單苗組顯著增加(P<0.05)。

表4 疫苗免疫后對單核細胞的影響 ×109個/L

2.3.5 APP、OmpH、APP+OmpH疫苗免疫后對仔豬紅細胞的影響

由表5可見，3種疫苗首免(6 w)及二免(9 w)后，對紅細胞數量影響差異不顯著(P>0.05)。

表5 疫苗免疫后對紅細胞的影響 ×1012個/L

2.4 血生化檢測

3種疫苗免疫后，檢測血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)含量。由圖7可見，每種疫苗免疫后總蛋白含量整體增高；二免后(9 w)，APP單苗組、APP+OmpH聯苗組較OmpH單苗組增高，差異極顯著(P<0.01)，APP+OmpH聯組較APP單苗增高顯著(P<0.05)；白蛋白各組間無明顯變化(P>0.05)；球蛋白呈上升趨勢，二免后，2個單苗組間無顯著差異(P>0.05)，APP+OmpH聯組與2個單苗組比較，增長極顯著(P<0.01)。

圖7 血清中TP、LB、GLB含量比較

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌和巴氏桿菌是豬場常見的呼吸道系統傳染病的致病菌，這兩種細菌在致病性上具有相似性，常呈混合感染，特別是慢性胸膜肺炎病例往往多繼發A型多殺性巴氏桿菌感染，給養豬業帶來巨大損失。目前，生產實踐中多采用疫苗控制上述疾病，常用的豬傳染性胸膜肺炎疫苗有滅活苗、弱毒苗和亞單位疫苗，豬肺疫疫苗有滅活苗及弱毒苗。上述疫苗均存在優缺點，其中滅活苗的成本低，安全、方便，但交叉保護能力差；弱毒苗交叉保護及免疫效果好，但有毒力返強的危險；亞單位疫苗安全，制備方便，需與適當佐劑配合，才能發揮最佳效果，其交叉保護能力不如弱毒苗，且滅活過程造成抗原表位缺失或抗原性減弱，導致免疫效果不確定且副作用較大等缺點。

研究表明，APP滅活苗可有效防止豬產生臨床癥狀，但無法抵御菌體于呼吸道系統的定殖，即仍可在免疫豬呼吸系統中分離出該病原菌，且特定血清型替換滅活苗無法保護豬不被異種血清型菌株感染。而APP菌影疫苗不僅可防止豬產生臨床癥狀，還可抵御菌體定殖，且Western blot試驗表明其具有交叉保護的潛力。巴氏桿菌OmpH抗原作為菌體外膜蛋白的一種，可有效誘導免疫動物產生特異性抗體反應，從而發揮保護作用。將OmpH質粒載入菌影，在菌影介導下，OmpH抗原在APC中表達并提呈，菌影進一步增強了OmpH抗原誘發免疫反應的能力，而且為機體提供了危險警示信號，起到了天然佐劑的作用。二者相輔相成，在發揮各自免疫作用的同時，又為免疫效應的強化發揮協同效應。

本試驗前期通過引入金黃色葡萄球菌核酸酶A，使其與噬菌體PhiX 174裂解蛋白E串聯表達，構建雙基因裂解系統，極大地提高了APP菌影的裂解效率。同時將多殺性巴氏桿菌保護性抗原OmpH質粒導入APP菌影，以其為載體，發揮靶向作用，通過小鼠試驗證明APP菌影裝載OmpH質粒二聯疫苗對APP和Pm感染均具有保護作用，保護率可達100%[9-11]。

體液免疫和細胞免疫在機體抗感染過程中起著重要的作用。抗體是一種由漿細胞分泌的蛋白質，在機體內有中和毒素、阻斷病原體入侵、清除病原微生物等多種作用[12]。細胞免疫主要通過T淋巴細胞介導，不同表型T淋巴細胞數量的改變對于監測免疫效果具有指導意義[13]。CD3+、CD4+和CD8+是T淋巴細胞的3個主要亞群，所以本研究主要評估以上3種免疫細胞的變化情況。結果表明，CD3+、CD4+和CD8+細胞比例呈較明顯上升趨勢，與經典弱毒苗、滅活苗免疫后，結果一致[14]。值得一提的是血清中抗體結果顯示，二聯疫苗二免后抗體上升顯著，單苗APP試驗組較OmpH試驗組抗體上升顯著，可能與二聯苗制備過程中裝載的OmpH質粒濃度有關，有待進一步驗證。本研究的實施，擴大了動物疫苗的研究方法，彌補了現有疫苗的部分缺點，豐富了疫苗品種，提高了豬傳染性胸膜肺炎和豬巴氏桿菌病疫苗的保護效率，對該病的防控具有一定的應用價值。