煙草黑脛病生防菌LG-3 的分離鑒定及防效研究

張幸博 ，郭小紅 ，劉玉珍 ，李建華 ，王 京 ，孫曉偉 ，法鵬飛 ，危月輝

（1.河南省煙草公司許昌市公司，河南 許昌 461000；2 福建三炬生物科技股份有限公司，福建 廈門 361001；3.福建省生物肥料企業(yè)工程技術研究中心，福建 廈門 361001）

煙草是中國的主要經濟作物之一，其總產量和總銷量居世界首位。但由于種植方式的改變，以及農藥、化肥的不合理施用，煙草的病蟲危害也日益加重。煙草黑脛病是國內危害最為嚴重的根莖病害之一，據(jù)調查表明，中國平均每年因煙草黑脛病造成的損失達上億元，僅次于煙草花葉病毒，嚴重影響了煙農的經濟收入［1］。

煙草黑脛病主要由煙草疫霉菌引起，在苗床期或移栽種植期均有可能發(fā)生，發(fā)病率一般在15%左右，嚴重可達75%，甚至造成絕收，嚴重影響煙草的產量和品質，給煙草產業(yè)造成較大的影響。煙草疫霉對煙草的侵染部位一般出現(xiàn)在莖部、根部和葉片，高溫、高濕條件下更易促使該病的發(fā)生［1，2］。

現(xiàn)階段，防治煙草黑脛病的方法有物理法、化學法和生物法，其中，化學防治方法效果最明顯，應用較為廣泛，但在化學防治病害的同時，也造成了一系列土壤污染、作物農藥殘留、病原菌產生抗藥性等問題［3，4］。物理法耗時耗力，操作繁瑣，因此，采用有效、溫和的生物防治手段尤為重要。目前，生物防治的相關生防菌有芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、木霉菌屬、鏈霉菌屬等［5-9］。本研究從煙草黑脛病重病區(qū)河南省許昌市采集土壤樣本，篩選分離出1 株新型黑脛病菌拮抗菌，并開展盆栽防效試驗，以期為煙草黑脛病生物防治方面的進一步探究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試煙草為中煙100。煙草黑脛病致病菌有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）W1G-2、煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）YM 致病菌，篩選于許昌市煙草病株。供試土壤為許昌市煙草土壤。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌）：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，加無菌水1 000 mL，pH 7.2～7.4；

2）PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂15～20 g，加無菌水1 000 mL，pH 7.0；

3）高氏1 號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌）：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 20 g，加無菌水 1 000 mL，pH 7.4～7.6。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的分離 稱取健康煙株根際土壤10 g，置于250 mL 錐形瓶中，隨后加入100 mL 無菌水，將錐形瓶置于220 r∕min 的振蕩器上振蕩5 min；配制成10-1～10-6稀釋度的根際土壤懸液；分別吸取100 μL 10-4～10-6不同稀釋度的土壤懸浮液，均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度設置2～3 個平行，而后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～7 d。待菌落長出，挑取單一的菌落移入相應的培養(yǎng)基進行純化，并進行菌落形態(tài)描述，挑取單菌落，制作切片，鏡檢，拍照，最后將純化后的單一菌株轉接到PDA 試管斜面上，置于 4 ℃冰箱中保存［10］。

1.2.2 拮抗菌的篩選 采用平板對峙法進行測定。將拮抗菌株活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24 h，在無菌條件下用已滅菌的直徑6 mm 打孔器制成菌碟，然后接種到PDA 固體培養(yǎng)基的四周；用已滅菌的直徑6 mm 打孔器將病原菌制成菌碟接種于PDA 培養(yǎng)基平板中間，以只接病原菌菌碟的處理為對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照長滿全平板時，觀查對峙培養(yǎng)結果，待抑菌圈不再變化時，記錄抑菌圈的大小并計算抑菌率，根據(jù)兩菌落發(fā)展速度、菌落之間有無抑菌圈、菌落邊緣的菌絲是否發(fā)生稀疏和萎縮的現(xiàn)象等來判斷分離的拮抗菌對病原菌有無拮抗作用，每處理3 次重復。

抑菌率=［（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）∕對照組菌落直徑］×100%

1.2.3 拮抗菌防效試驗 試驗于福建省漳州市南靖縣福建三炬生物股份有限公司玻璃實驗室大棚內進行，選擇健壯、長勢一致的煙苗，移栽到花盆中。對照（CK）取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆，24 h 后移栽煙苗，同時加入20 mL 無菌水于根部。移栽后7 d 再加1 次無菌水。處理取20 mL 105CFU∕mL 病原菌菌液施入花盆中，24 h 后移栽煙苗，同時加入20 mL 108CFU∕mL 拮抗菌菌液于根部，移栽后7 d 再加1 次拮抗菌菌液。將4 個拮抗菌株與2 株病原菌進行拮抗比較，每處理10 株煙苗，設3 次重復。

移栽后15 d 觀察煙株的發(fā)病情況，煙草黑脛病致病分級標準參照中華人民共和國煙草行業(yè)標準（YC∕T 39—1996）。

相對防效=（FCK-F）t∕FCK×100%，其中，F(xiàn)CK表示空白組病情指數(shù)；Ft表示處理組病情指數(shù)。

1.2.4 拮抗菌的鑒定 將純化后的拮抗菌斜面送至國家農業(yè)農村部進行菌種鑒定，并由農業(yè)農村部送至指定單位進行毒理檢測。

2 結果與分析

2.1 煙草黑脛病拮抗菌分離、篩選

采用3 種培養(yǎng)基對煙草植株體及根際土壤菌株進行分離，挑取分離平板上的單菌落進行多次劃線純化，直至分離出單菌落，記錄單菌落的形態(tài)特征、編號、斜面，保存。最終從采集的煙草土壤樣品中共分離得到 35 株菌株，包括 29 株細菌、4 株真菌、2 株放線菌。結果表明，煙草根際土壤中分布有大量的微生物，以細菌最多，真菌次之，放線菌最少。

將篩選的菌株進行液態(tài)培養(yǎng)，取發(fā)酵液進行病原菌拮抗試驗，其中，有4 株菌株對供試病原菌均有明顯的抑制作用，將4 個拮抗菌株與2 株病原菌進行拮抗比較，每處理10 株煙苗，設3 次重復。試驗設計如表1 所示。

表1 拮抗防效盆栽處理設計

LG-12、LG-3、LT-10、LJ-11 對 2 種黑脛病病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果（表2、圖1A、圖1B），其中，對煙草黑脛病抑菌效果最好的為LG-3，抑菌圈直徑分別達39、28 mm，與其他3 種分離菌株之間差異達極顯著水平。

表2 分離菌株對煙草黑脛病病原菌生長的抑制

圖1 LG-3 對煙草黑脛病病原菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌對煙草黑脛病的防效

以添加清水作為對照，通過在苗期人為添加病菌 W1G-2、YM 和拮抗菌，15 d 后觀察煙苗生長情況。接種病菌W1G-2、YM 后，煙苗莖部發(fā)黑，無新葉生長。由表3 可知，接種煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae）LG-3 對煙草黑脛病的防治效果最好，相對防效達85.59%，其他拮抗菌防效相對較低。

表3 煙草節(jié)桿菌對煙草黑脛病的防效情況

2.3 菌種鑒定及菌種安全性

將對煙草黑脛病抑菌效果較好的LG-3 菌株純化后送至農業(yè)農村部微生物肥料和食用菌菌種質量監(jiān)督檢驗測試中心進行菌種鑒定，結果表明，LG-3菌株的16S rDNA 序列和RecA基因序列與煙草節(jié)桿菌的序列同源性為99%。在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，24 h菌落圓形，微隆起，邊緣整齊，表面濕潤，呈淡黃色（圖2A）。該菌為革蘭氏陽性菌，細胞幼齡桿狀，老齡斷裂呈小球狀，有明顯的桿、球周期變化（圖2B）。

煙草節(jié)桿菌在煙草上乃至農業(yè)上的應用鮮見報道，為1 株新型煙草黑脛病拮抗菌株。為后續(xù)能在煙草病害防治或農業(yè)生防方面加以應用，本研究參考微生物肥料生物安全通用技術準則（NY 1109—2006），將煙草節(jié)桿菌LG-3 送至匯智泰康生物技術（北京）有限公司進行急性經口毒性試驗，結果表明，雌性、雄性小鼠經口半致死量（LD50）均大于10 g∕kg BW，屬實際無毒。

圖2 煙草節(jié)桿菌LG-3 的菌落形態(tài)及鏡檢結果

3 小結與討論

煙草黑脛病現(xiàn)階段仍以化學防治為主，主要施用抗菌劑，但長期施用化學制劑容易造成土壤污染、農藥殘留和環(huán)境污染，給人體健康和生態(tài)環(huán)境造成威脅。生物防治是符合健康、安全、環(huán)保可持續(xù)發(fā)展的手段。微生物對植物病原菌生長的抑制作用機制主要有代謝產物含抗菌物質、寄生于病原菌、與病原菌競爭營養(yǎng)和空間、或誘導植物產生系統(tǒng)抗病性等［11-14］。目前，對于煙草黑脛病的生物防效已有許多報道。喻會平等［15］篩選的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和惡臭假單胞菌單獨使用的防效和組合菌的防效分別達60%和70%以上；Han 等［16］篩選的枯草芽孢桿菌Tpb 55 在盆栽和大田試驗的防效分別為70.66%和59.34%；彭閣等［17］從煙草病株中篩選出5 株對煙草黑脛病具有較好抑制效果的真菌，其中，里氏木霉、煙曲霉和黑曲霉的防效分別為59.50%、61.82%和85.00%；黃大躍［18］從土壤中篩選出1 株對煙草疫霉抑制作用最好的鏈霉菌F-7，抑菌率達75.00%，但在盆栽生防試驗的效果不明顯，不能起到控制病情的作用；曹明慧等［19］從健康煙株的根際土壤中分離出1 株多粘類芽孢桿菌C-5，煙草苗期的防效達80%。

本研究首次從煙草根際土壤中篩選出1 株煙草節(jié)桿菌，對其進行毒理試驗和防效試驗，結果表明，該菌在煙草苗期表現(xiàn)出較好的生防效果和促生長作用，對黑脛病防效達85.59%；除此之外，有研究報道煙草節(jié)桿菌對五氯硝基苯殺菌劑具有降解作用［20］。說明煙草節(jié)桿菌在煙草病害和農藥殘留降解中都具有良好的研究和開發(fā)前景。經口毒性試驗為實際無毒，屬于安全、高效的生防菌株。但其防治機理尚待進一步研究。