不同濃度6-BA 對變異株云煙97 繼代培養的影響

張麗瓊，陳 迪，楊松杰，聶祥濤

（安康學院現代農業與生物科技學院，陜西 安康 725000）

煙草作為經濟作物，一直是植物生物工程學、植物分子遺傳學的主要研究對象［1］，在遺傳學與生物工程學的各領域中，煙草的離體培養也可以為其他植物組織培養提供參考資料。研究者在煙草莖切斷和髓培養研究中，確定了嘌呤∕IAA 的比例是控制根和芽形成的條件［2］。詹紅等［3］研究了 6-BA 和 NAA不同濃度對煙草植物組織的影響，經過試驗證明，在MS+6-BA 0.5 mg∕L+NAA 0.5 mg∕L 培養基上，煙草的出芽率最高，但是在高濃度NAA 下對芽的生長有影響。何余勇等［4］以不同生長調節劑濃度配比處理云煙97 變異株，優化該變異株培育的快繁體系，觀察結果顯示，MS+6-BA 2.0 mg∕L+NAA 0.2 mg∕L 是誘導愈傷組織和不定芽分化的最佳培養基，1∕2MS+6-BA 0.1 mg∕L+IBA 0.5 mg∕L 是誘導生根的最佳培養基。何川生等［1］利用K326、紅大、G-28 種子為材料，對煙草的快速繁殖進行了研究，試驗結果表明，MS+6-BA 0.3 mg∕L+IBA 0.05 mg∕L 是最適宜這 3 種外植體誘導芽分化的培養基。MS+6-BA 3.0 mg∕L+IBA 0.2 mg∕L 是繼代培養中的最適培養基，培養 1 個月左右后均有幼芽形成，繼續培養1 個月后可以長出根。

陜西省安康市鎮坪縣從2010 年開始種植烤煙，種植面積穩定在200 hm2左右，屬于當地的特色經濟作物，為增加農民收入和財政稅收作出了一定貢獻。2016 年全縣共種植烤煙186.67 hm2，簽訂種植合同108 份，共收購煙葉350 t，收購總資金798.76 萬元，戶均收入7.4 萬元。2016 年9 月在鎮坪縣引進種植的云煙97 中發現2 株超高未現蕾的巨型變異株，全株無病蟲害，煙葉烤后呈檸檬黃色，組織疏松、光澤鮮亮、油分充足、質量上乘。通過與普通對照株比較，發現其有較大的生長優勢，株高3.4 m，莖圍17.5 cm，葉片數129 片，平均 1～3 d 萌發 1 片新葉，而未變異云煙97 對照株株高僅115.3 cm，有效葉片20 片左右，節距 5.7 cm，莖圍 9.7 cm，每 5 d 左右萌發 1 片新葉。

煙草組織培養適宜培養基研究的較多，但不一定適宜于云煙97 變異株腋芽的組培快繁，因此有必要探索適于云煙97 變異株快繁的培養基。為保存這一優良的種質資源，本研究利用組織培養快速繁殖的方法，以MS 為基礎培養基，研究不同濃度6-BA對云煙97 變異株初代培養組培苗繼代培養的影響，以期利用該變異株腋芽進行快速繁殖，通過組織培養技術獲得大量無菌苗，培育出遺傳穩定的云煙97變異株，研究出的快速繁殖技術可用于生產，為大面積推廣種植云煙97 變異株提供種苗，對鎮坪縣烤煙生產的發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用煙草為2016 年9 月在陜西鎮平縣田間發現的2 株超高未現蕾的巨型變異株云煙97 腋芽初代培養的組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將變異株云煙97 腋芽初代培養的組培苗切成1 cm×1 cm 左右小塊，放置在添加了不同濃度 6-BA（1.0、2.0 mg∕L）的 MS 固體培養基內進行二代培養，分別用A、B 來表示，以不添加6-BA的MS 固體培養基為對照，每瓶接種5 個外植體，每種處理30 個重復，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h光照條件下培養。將二代培養中生成的愈傷組織轉移到含有不同植物生長調節劑組合的MS 固體培養基內（表1），基本培養基配方為：MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH 為5.8。愈傷組織切成1 cm×1 cm 左右小塊，每瓶接種4～5 個愈傷組織，每種處理30 個重復，在（25±2）℃，2 000 lx，每天14 h 光照條件下培養。

表1 三代培養基

1.2.2 數據分析 記錄每組煙草愈傷組織的生長情況和芽的發生率，并用Excel軟件處理試驗數據。其中，愈傷組織形成率=形成愈傷組織數∕接種外植體數×100%，出芽率=形成芽的愈傷組織塊數∕接種愈傷組織塊數×100%，污染率=污染的外植體數∕總外植體數×100%，褐變率=褐變的外植體數∕總外植體數×100%。

2 結果與分析

2.1 二代培養的結果分析

2.1.1 二代培養觀察結果 接種后對第5 天到第25天煙草變異株二代培養的變化進行觀察，結果（表2）表明，第10 天時3 個處理中外植體均開始增大，并出現愈傷組織，在第15 天時處理B 首先出現芽，處理CK 與處理A 在第25 天時有芽的形成；培養到第25 天，在 CK 處理中，共有 10 瓶出現污染，6 瓶出現褐變；在A 處理中，共有3 瓶部分出現污染，6 瓶出現褐變；在B 處理中，共有4 瓶出現污染，4 瓶部分出現褐變。經過比較3 個處理的長勢、污染、褐變情況，可以看出處理B 較為適宜作二代培養基。

表2 二代培養觀察結果

2.1.2 不同植物生長調節劑含量對愈傷組織形成的影響 分析不同植物生長調節劑含量對煙草變異株愈傷組織形成的影響，由表3 可知，處理CK 的褐變率與污染率均為3 個處理中最高，愈傷組織形成率最低；處理A 的污染率最低，為11.7%，處理B 次之；處理B 的褐變率最低，為13.3%，處理A 次之；處理B的愈傷組織形成率最高，為88.3%，處理A 次之。隨著6-BA 濃度的升高，煙草變異株愈傷組織形成率呈上升趨勢，通過綜合比較，處理A 與處理B 雖然在污染率與褐變率上相差較小，但處理B 形成的愈傷組織數及總體長勢更好（圖1），因此，在二代培養中，愈傷組織形成率隨6-BA 濃度升高呈上升趨勢，且MS+2.0 mg∕L 6-BA 培養基更適合誘導該變異株愈傷組織的形成。

表3 不同植物生長調節劑含量對愈傷組織形成的影響

圖1 處理A 和處理B 愈傷組織的形成比較

2.2 三代培養的結果

2.2.1 三代培養觀察結果 在二代培養的基礎上，選擇合適的愈傷組織作為繼代培養的外植體，轉移到含有不同植物生長調節劑組合的MS 固體培養基內進行繼代培養，定期進行觀察。

第5 天時，所有處理中愈傷組織均無明顯變化（表 4）；第10 天時，處理A3、A5 首先有嫩芽形成，處理A6、A7 出現芽點；第15 天時，各處理中均形成嫩芽或芽點，其中處理A5 的長勢最好；第25 天時，各處理中有叢生芽出現，處理A5 的莖增高，處理A2、A3 有根出現；到第 25 天，A1 處理共有 5 瓶出現污染，4 瓶出現褐變；在A2 處理中，共有4 瓶出現污染，3 瓶出現褐變；在 A3 處理中，共有 3 瓶出現污染，1 瓶出現褐變；在A4 處理中，共有5 瓶出現部分污染，4瓶出現褐變；在A5 處理中，共有2 瓶出現污染，無褐變；在A6 處理中，共有3 瓶出現污染，1 瓶出現部分褐變；在A7 處理中，共有2 瓶出現污染，2 瓶出現部分褐變；在A8 處理中，共有3 瓶出現污染，4 瓶出現褐變；在A9 處理中，3 瓶出現污染，4 瓶出現部分褐變；在 A10 處理中，4 瓶出現污染，6 瓶出現褐變。

2.2.2 不同生長調節劑組合對煙草變異株愈傷組織分化芽的影響 在不含NAA 的條件下（表5），隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在本試驗條件下6-BA 濃度為2.0 mg∕L 時有利于促進愈傷組織芽的分化，但當6-BA 濃度升到3.0 mg∕L時，分化成芽率呈下降趨勢，經比較，處理A3 的污染率與褐變率均低于其他3 個組合，且分化成芽率最高，由此說明，在單獨使用 6-BA 時，MS+2.0 mg∕L 6-BA 培養基適合用于煙草變異株愈傷組織分化。

在 NAA 濃度為 0.2 mg∕L 的條件下，6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時愈傷組織分化成芽率最高，即處理A5，而當 6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 和 3.0 mg∕L 時，分化成芽率較低，說明當 NAA 濃度為 0.2 mg∕L 時，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在6-BA濃度為 1.0 mg∕L 時最高。

在 NAA 濃度為 0.5 mg∕L 的條件下，6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時，分化成芽率為 62.4%，6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 時，分化成芽率為 73.6%，在 6-BA 濃度為 3.0mg∕L 時，分化成芽率為 53.9%，說明當 NAA 濃度為0.5 mg∕L 時，6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 對芽的分化作用較好。

表4 繼代培養觀察結果

表5 不同生長調節劑組合對煙草變異株愈傷組織分化芽的影響

處理 A5（NAA 濃度為 0.2 mg∕L，6-BA 濃度為1.0 mg∕L）愈傷組織分化成芽率最高，為88.9%，其污染率與褐變率在所有處理中均為最低，故此培養基適宜進行云煙97 變異株腋芽的繼代培養。

3 討論

本試驗分別探討了不同濃度6-BA 對愈傷組織誘導以及加入NAA 后6-BA 濃度對芽分化的影響，試驗結果表明，變異株云煙97 在二代培養中，在A處理與B 處理中均能形成愈傷組織，在A 處理中分化率為76.7%，B 處理中分化率為88.3%，B 處理的愈傷組織分化較高，說明在二代培養中最優培養基配方為 MS+2.0 mg∕L 6-BA，這與陳剛［5］在對該變異株進行組織培養研究中得出的MS+2.0 mg∕L 6-BA 結果一致。

在三代培養中，當不使用NAA 時，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在6-BA濃度為 2.0 mg∕L 時達到最高，但當 6-BA 濃度升為3.0 mg∕L 時，分化成芽率呈下降趨勢。當 NAA 濃度為0.2 mg∕L 時，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在 6-BA 濃度為 1.0 mg∕L 時最高。當 NAA 濃度為 0.5 mg∕L 時，逐漸增加 6-BA 濃度對芽分化有促進作用，但當6-BA 濃度達3.0 mg∕L時，對芽分化起抑制作用。

在各處理中，處理A5 愈傷組織分化成芽率達到最高，為88.9%，污染率、褐變率均較低，因此在繼代培養中，更適合該變異株愈傷組織分化成芽的培養基組合是 MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA，這與陳剛［5］的研究結果一致。何余勇等［4］得出 MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.2 mg∕L NAA 是誘導愈傷組織和不定芽分化的最佳培養基，這與本研究結果不一致，原因可能是試驗采用的材料及培養條件不同導致的。

4 小結

以云煙97 變異株腋芽為外植體，在25 ℃、2 000 lx、每天14 h 光照的條件下，二代培養時愈傷組織形成率隨6-BA 濃度的升高呈上升趨勢，最適培養基為MS+2.0 mg∕L 6-BA。三代培養基不使用NAA 時，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織分化成芽率逐漸上升，在 6-BA 濃度為 2.0 mg∕L 時較高，但當 6-BA 濃度升高為3.0 mg∕L 時，分化成芽率有所下降。當NAA 濃度為 0.2 mg∕L 時，愈傷組織分化成芽率隨著6-BA 濃度的升高逐漸降低，且在6-BA 濃度為1.0 mg∕L 時最高。當 NAA 濃度為 0.5 mg∕L 時，逐漸增加6-BA 濃度對芽分化有促進作用，但當6-BA 濃度達3.0 mg∕L 時，對芽分化起抑制作用。通過比較愈傷組織分化成芽率，三代培養最適培養基為MS+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L 6-BA。