乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮工藝優(yōu)化

程時(shí)勁，余 渤，毛 博，許星星，李安迪，劉曉霞

（武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，武漢 430212）

紅葉李又名紫葉李，屬于薔薇科李，是一種落葉小喬木，樹體的高度最高達(dá)8 m 左右［1］。研究表明，紅葉李中含有豐富的黃酮成分［2-4］，具有重要的研究與開發(fā)價(jià)值。黃酮類化合物常作為一些中草藥的有效成分而被廣泛研究，其中作為中藥的活性成分大多存在于植物的葉片和花瓣中［5-7］。黃酮類化合物具有十分廣泛的應(yīng)用［8，9］，近年來黃酮類化合物主要應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品方面，其中在醫(yī)藥方面有治療腫瘤用藥、消炎藥、止疼藥、降低血糖用藥、胃藥和護(hù)肝藥等［10］；在護(hù)膚品方面主要應(yīng)用這類化合物延緩老化和預(yù)防氧化的功能而開發(fā)高檔護(hù)膚品類［11］。本研究對(duì)紅葉李中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，通過改變提取溶劑的類別，采用不同濃度的提取溶劑，改變料液比，改變提取溫度和提取時(shí)間，分別在不同條件下測(cè)定總黃酮的提取率，得出最佳優(yōu)化工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（UV≥98%，上海金穗生物科技有限公司），以上試劑均為分析純。

101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的FW135 型中草藥粉碎機(jī)；UV-4802H 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

將采摘好的紅葉李葉片用自來水漂洗3 次，洗去表面的綠色蟲卵及灰塵等，再用去離子水浸泡漂洗3 次，將洗凈的葉片鋪于潔凈的紗布上置于烘箱中50℃10 h 烘至恒重，干燥后的葉片保存在密封袋中。用中草藥粉碎機(jī)將葉片粉碎并過篩，將粉末保存在密封袋中備用。

分別稱取5 份0.5 g 的紅葉李粉末，按順序倒入已編號(hào)的5 個(gè)250 mL 的燒杯中，往各個(gè)燒杯中分別加入去離子水、丙酮、石油醚、70%乙醇、乙酸乙酯30 mL。將所有樣品置于60 ℃恒溫水浴箱中浸提30 min。取出燒杯后過濾，用50 mL 的容量瓶收集濾液后70%乙醇定容得粗提液，將粗提液稀釋10 倍得樣品液。再取一個(gè)50 mL 容量瓶加入亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻后靜置6 min；再依次加入10%A（lNO3）3溶液2 mL 和4%NaOH 溶液20 mL，用70%乙醇將其定容后搖勻放置15 min，得到參比液。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度，然后計(jì)算出總黃酮的提取率。

按照上述方法，改變提取溶劑乙醇的濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%；改變料液比分別為 1∶15、1∶30、1∶45、1∶60（g∶mL）；改變提取溫度分別為 40、50、60、70、80 ℃；改變浸提時(shí)間分別為10、30、50、70、90 min，再經(jīng)過同樣的處理和測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)和工作曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與紅葉李樣品的最大吸收波峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)相同，均為508 nm，因此確定測(cè)量的紅葉李樣品液吸光度的最大吸收波長(zhǎng)為508 nm，并將其作為紅葉李總黃酮含量的測(cè)定波長(zhǎng)，如圖1 所示。用紫外可見分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線，如圖2 所示，工作曲線回歸方程為Y=0.011 28X+0.034 77，R2=0.999 34。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在 8～48 mg∕mL范圍內(nèi)，紅葉李的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品紫外可見光譜

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線

2.2 總黃酮提取率的計(jì)算

將測(cè)出的樣品溶液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程中算出樣品溶液中總黃酮的濃度，然后根據(jù)稀釋的倍數(shù)反算出提取的總黃酮質(zhì)量，與所取的紅葉李粉末質(zhì)量相比即可得出提取率，其計(jì)算公式為：Q=（C×V×10∕m）×100%

式中，Q為總黃酮提取率（%）；m為紅葉李葉片粉末質(zhì)量（g）；C為總黃酮濃度（mg∕mL）；V為粗提液稀釋后的體積（mL）。

2.3 提取溶劑及其濃度優(yōu)化

選用不同提取溶劑將紅葉李粉末在60 ℃水浴鍋中浸提30 min，不同溶劑提取后紅葉李樣品溶液的提取率如圖3 所示。由圖3 可知，紅葉李總黃酮提取率高低依次為70%乙醇、丙酮、去離子水、石油醚、乙酸乙酯，所以選擇70%乙醇為提取溶劑。

圖3 不同提取溶劑下總黃酮提取率

選用不同濃度的乙醇將紅葉李粉末置于60 ℃恒溫水浴箱中浸提30 min，經(jīng)不同濃度乙醇溶液提取后紅葉李樣品溶液的提取率如圖4 所示。由圖4可知，當(dāng)乙醇濃度小于70%時(shí)，紅葉李中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度增大而上升，當(dāng)乙醇濃度超過70%時(shí)提取率反而下降，所以最佳的乙醇提取濃度為70%。

2.4 料液比的優(yōu)化

圖4 提取率隨乙醇濃度變化情況

選用幾種不同料液比的70%乙醇溶液與紅葉李粉末放入60℃的恒溫水浴箱中浸提30 min，料液比不同，總黃酮的提取率也不同，提取率與料液比的關(guān)系曲線見圖5。由圖5 可知，紅葉李中總黃酮的提取率隨著溶劑量的增加而呈上升趨勢(shì)，在料液比小于1∶45 時(shí)上升明顯，而在料液比超過1∶45 時(shí)上升幅度趨于平緩。考慮到溶劑量再繼續(xù)增大會(huì)消耗更多的提取試液和提取時(shí)間，提取效率增長(zhǎng)甚微，所以選擇1∶45 為提取紅葉李中總黃酮的最佳料液比。

圖5 總黃酮提取率與料液比的關(guān)系曲線

2.5 提取溫度的優(yōu)化

將料液比為1∶45 的70%乙醇溶液浸提的紅葉李粉末置于溫度不同的恒溫水浴箱中浸提30 min，改變提取溫度，樣品的總黃酮提取率也隨之發(fā)生變化，提取率與溫度之間的關(guān)系見圖6。由圖6 可知，40～70 ℃，總黃酮提取率隨著溫度的增加而上升；70～80 ℃，提取率隨著溫度的增加而下降，所以選擇70 ℃為乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮的最佳提取溫度。

圖6 總黃酮提取率隨溫度上升的變化趨勢(shì)

2.6 提取時(shí)間的優(yōu)化

選用70%的乙醇溶液，料液比為1∶45，在溫度為70 ℃的恒溫水浴箱中浸提不同時(shí)間后紅葉李樣品溶液的總黃酮提取率如圖7 所示。由圖7 可知，乙醇浸提法提取紅葉李中總黃酮的提取率隨提取時(shí)間的增加而上升，但在提取時(shí)間超過70 min 之后提取率上升趨勢(shì)趨于平緩，故為了提高試驗(yàn)效率，選擇70 min 為最佳提取時(shí)間，此時(shí)提取率為8.24%。

圖7 總黃酮提取率隨提取時(shí)間變化情況

3 小結(jié)

本試驗(yàn)以新鮮紅葉李葉片低溫烘干研磨后的粉末為原料，研究探討了紅葉李葉片總黃酮提取工藝的優(yōu)化條件。采取了乙醇浸取法提取紅葉李中的總黃酮，通過改變提取溶劑的種類、采用不同提取溶劑的濃度，改變料液比，在不同的提取溫度和提取時(shí)間下測(cè)定提取率，最終確定了紅葉李總黃酮提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度為70%，料液比為1∶45，在70℃的恒溫水浴箱中浸提70 min，此時(shí)紅葉李中的總黃酮提取率最高，可達(dá)8.24%。