中寧-格爾木產區寧杞一號干果蛋白質組學研究

孫西予，牛思思，趙廷彬，趙丹青，余君偉，喬長晟，，7*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.工業發酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457；3.杞源堂（天津）生物工程有限公司，天津 300453；4.天津慧智百川生物技術有限公司，天津 300457；5.寧夏農林科學院，寧夏 銀川 750002；6.寧夏中農艾森檢測有限公司，寧夏 中寧 755100；7.天津市微生物代謝與發酵過程控制工程技術中心，天津 300457）

枸杞子是茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥成熟果實，夏、秋二季果實呈紅色時采收，熱風烘干或晾至皮皺后曬干，最后除去果梗。自古以來，枸杞一直廣泛分布全國各地，主產于寧夏、甘肅、青海、新疆等西北省份的沙區附近，東北省區也有分布。目前在中國境內生長的枸杞就有多達10個品種，其中中國枸杞屬種質資源的原始品種有7種，另外還出現了3個變種[1-3]。自明清后，寧夏中寧枸杞質優成為業內共識，在此基礎上，以寧夏枸杞子為道地藥材，并結合果實本身的性狀（果實的大小、形狀、色澤、氣味等）進行評價，為制定枸杞子商品規格等級標準提供了依據。由于我國枸杞資源分布廣泛、種類繁多，因此需要有準確、便捷地鑒別枸杞道地性的技術，以確保枸杞種植者和消費者的利益。

目前已有一些文獻報道采用基于凝膠電泳和質譜技術對某些植物的蛋白組學進行研究，從而解析其屬性差異。華愉教等[4]使用iTRAQ定量蛋白質組學技術對江蘇句容白龍地及福建柘榮、安徽宣州、貴州施秉種植基地的太子參之間的差異蛋白質進行了對比，為解析不同產地太子參次生代謝物差異的成因及其藥材品質形成的蛋白質機制提供了參考；Wang Y等[5]對水稻的愈傷組織、葉片、根、芽分生組織、幼穗和成熟穗進行了磷酸化蛋白的定量蛋白質組學研究，研究范圍幾乎覆蓋了所有的磷酸化蛋白；王溢[6]使用非標記定量（label-free）蛋白質組學技術對青楊3個不同的葉位進行比較蛋白質組學的分析，共檢測到111個差異表達蛋白質，說明了青楊葉片成熟到衰老是受蛋白質表達變化有序調控的過程。但使用蛋白質組學研究枸杞干果的案例較少。本文以lable-free技術作為蛋白質組學的檢測手段，對寧夏中寧和青海格爾木兩個產地的枸杞干果樣品進行蛋白質組學的分析。lable-free技術全稱為“非標記定量蛋白質組學技術”，該技術的特點是：無需對樣本蛋白質添加標記；對各種蛋白質的豐度變化敏感；對低豐度肽段的識別能力強。通過對比兩產地樣品之間的差異蛋白質，為鑒別寧杞一號的產地提供了一些科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

枸杞干果：品種為寧杞一號，采自寧夏中寧、青海格爾木。

1.1.2 主要試劑及產品來源

甘油（分析純）、溴酚藍（分析純）、牛血清白蛋白（分析純，≥98.0%）：上海生工生物工程公司；十二烷基硫酸鈉（電泳級，≥98.0%）、尿素（電泳級，≥99.0%）、二硫蘇糖醇（電泳級，≥99.4%）、碘乙酰胺（電泳級，≥98.0%）：Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（分析純，≥99.0%）、NH4HCO3（最優生化級，≥99.5%）、三氟乙酸（色譜級，≥99.0%）、甲酸（色譜純，≥98%）：Sigma公司；KH2PO（4分析純，≥99.5%）、KC（l分析純，≥99.5%）、HC（l分析純，36.0%～38.0%）：國藥集團化學試劑有限公司；BCAn kit定量試劑盒：碧云天生物技術有限公司；胰蛋白酶（色譜純）：北京普洛麥格生物技術有限公司；乙腈（色譜純，≥99.9%）：德國默克有限公司；液氮：天津昊瑞氣體銷售有限公司。

1.1.3 儀器和設備

Easy nLC色譜系統、Q Exactive質譜儀、Multiskcan FC酶標儀：賽默飛世爾科技公司；AKTA Purifier 100蛋白純化儀、EPS601電泳儀：通用電氣醫療集團；5430R低溫高速離心機、Concentrator Plus真空離心濃縮儀：艾本德（上海）國際貿易有限公司；MP Fastprep-24勻漿儀：安諾倫（北京）生物科技有限公司；JY92-II超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；GNP-9080恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；QT-1 Votex振蕩器：上海琪特分析儀器有限公司；AL104電子天平：梅特勒托利多集團。

1.2 方法

1.2.1 樣品蛋白質的提取

參考Gabriella等[7]的方法，使用三氯乙酸-丙酮混合液沉淀后加十二烷基硫酸鈉裂解液，該方法能有效提取枸杞干果中的蛋白質。

1.2.2 樣品蛋白質的定量

采用二辛可寧酸（bicin choninic acid，BCA）法[8]對濾液進行蛋白質定量。用BSA配制濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準品；按體積比50∶1（A液∶B液）配制適量BCA工作液，充分混勻，BCA工作液室溫24℃穩定24 h。（1）將標準品按 0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96孔板的標準品孔中，加標準品稀釋液補足到20 μL；（2）加20 μL樣品到96孔板的樣品孔中；（3）各孔加入200 μLBCA工作液，37℃放置20 min～30 min。BCA法測定蛋白濃度時，顏色會隨著時間的延長不斷加深；（4）用酶標儀測定A562或A540～A595之間的其它波長的吸光度；（5）根據標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度，分裝樣品后于-80℃條件下保存。

1.2.3 樣品蛋白質的酶解

用超濾管酶解法（filter-aided sample preparation，FASP）酶解蛋白質樣品[9-10]，先用胰蛋白酶將樣品蛋白質分解為肽段，再用C18固相萃取小柱對肽段進行脫鹽，加入0.1%甲酸、5%乙腈水溶液洗脫復溶，最后檢測肽段的OD280進行定量。

1.2.4 液相色譜（liquid chromatography，LC）分析

根據BCA定量和肽段定量得到的酶解液濃度，取0.1%甲酸復溶至0.5 μg/μL的樣品肽段裂解液進入Easy nLC液相色譜系統上樣，該系統可以通過二級串聯液相色譜技術實現以納升級別的流速對樣品進行分離。具體液相條件參考向偉等[11]的方法。

1.2.5 質譜（mass spectrometry，MS）分析

使用Q-Exactive質譜儀和液相色譜系統串聯進行樣品質譜分析，質譜條件的設定參考向偉等[11]的方法。

1.2.6 Maxquant非標記分析

將樣品蛋白質的LC-MS原始數據導入Maxquant軟件（版本號1.5.3.17），對檢測到的蛋白質進行數據庫匹配[12]，對兩產地樣品蛋白質的數據進行鑒定和相對表達量的比較。本研究使用的Lable-free定量算法的原理為：以一級質譜（MS1）為基礎，將質譜數據轉化成以色譜保留時間和質荷比（m/z）為變量的二維圖譜，在該二維圖譜的基礎上再增加MS1中的肽段強度變量，從而將最原始的質譜數據轉換成形象的三維圖譜，最后利用Maxquant解析這些肽段的定量信息，從而獲得對應蛋白質的相對定量比值[13-14]，而MS1中肽段的鑒別是通過Maxquant軟件集成的搜索引擎Andromeda對二級質譜（MS2）的檢測結果進行數據庫檢索實現的。Maxquant軟件的蛋白質數據庫檢索參數如表1所示。

表1 Maxquant軟件的蛋白質數據庫檢索參數Table 1 Parameters of protein database search with maxquant software

1.2.7 差異蛋白質的篩選

以寧夏中寧產區的寧杞一號為對照樣品，將青海格爾木產區的寧杞一號非標記定量數據非標記定量法（label-free quantification，LFQ）與其對比，將一組樣品中兩次及以上不為空值，另一組所有數值均為空值的蛋白直接作為差異蛋白，其它兩地樣品均含有差異蛋白質篩選的條件為：P值小于0.05，上下調差異倍數2倍以上，如果上下調差異倍數小于2倍則認為該蛋白質表達量無差異。

1.2.8 差異蛋白質的層次聚類分析

先根據定量信息計算兩產地枸杞樣本之間的蛋白質差異表達倍數（格爾木/中寧）；然后通過顯著性檢驗計算兩產地樣本蛋白質表達量之間的P值；取蛋白質差異表達倍數的log2Fold Change值為橫坐標，取兩產地樣本間P值的-log10P值為縱坐標，通過這兩個維度進行作圖；最后將分析結果以火山圖的方式展現。

1.2.9 通過信息生物學分析差異蛋白質

采用 GO 數據庫（http：//www.geneontology.org/）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路數據庫（http：//www.genome.ad.jp/kegg/）對差異蛋白進行 GO功能注釋和參與的代謝通路分析，獲得差異蛋白質的生物功能、參與的生物過程以及細胞定位等信息。

2 結果與分析

2.1 差異蛋白質的篩選

差異蛋白質的檢測結果見表2。

表2 差異蛋白質的檢測結果Table 2 Differential protein detection results

如表2所示，在兩組樣品中共檢測到2 477種蛋白質，中寧產區的樣品中共檢測到1 942種蛋白質，格爾木產區的樣品中共檢測到2 065種蛋白質。其中，中寧產區的樣品特有的蛋白質有174種，格爾木產區的樣品特有的蛋白質有297種，兩產地樣品共有的蛋白質有1 768種。中寧產區樣品的表達量超過格爾木產區樣品的蛋白質有69種，中寧產區樣品的表達量低于格爾木產區的蛋白質有86種。

2.2 蛋白質表達量的火山圖

通過火山圖對兩產地樣品的蛋白質表達量進行分析，結果如圖1所示。

圖1 火山圖Fig.1 Volcano plot

圖1中“倒三角”的圖標表示的是表達量有顯著上調的蛋白質（格爾木/中寧），“菱形”的圖標表示的是表達量有顯著下調的蛋白質（格爾木/中寧），每個表示蛋白質的點橫、縱坐標的離散程度越大說明蛋白質的差異表達越明顯。從圖1中的分類結果可以看出，中寧產區和格爾木產區兩地枸杞樣品的組間差異明顯，具備進行更深層次的生物信息學分析的條件。

2.3 差異蛋白功能注釋與分類

對差異蛋白質進行GO分析，采用Blast2GO軟件對篩選出的差異表達蛋白質的功能進行注釋和分類，分為生物過程、分子功能和細胞組分3部分，分析結果如圖2所示。圖中條形圖后面的數字為該條目的富集因子。

圖2 差異蛋白質的GO分析Fig.2 GO analysis of differentially expressed proteins

由GO分析的結果可知，寧夏中寧樣品和青海格爾木樣品的差異蛋白質主要集中在以下3個方面：（1）生物過程：細胞或亞細胞成分的運動、基于微管的運動、鐵離子轉運、蛋白質穩定性、過渡金屬離子轉運、蛋白質穩定性的調節、氨基糖代謝過程、細胞壁大分子分解過程；（2）分子功能：鐵離子結合、作用于配對供體的氧化還原酶活性、單加氧酶活性、金屬離子氧化還原酶活性、氧為受體的金屬離子氧化還原酶活性、鐵氧化酶活性；（3）細胞成分：細胞質的核周區域、光合膜、細胞表面、類囊體組分、類囊體膜、類囊體。

2.4 差異蛋白質KEGG分析

對這些差異蛋白質進行KEGG代謝途徑富集分析，排除動物、細菌等與植物無關的代謝途徑，結果如圖3所示。圖中條形圖后面的數字為該條目的富集因子。

由圖3可知，這些代謝途徑包括：礦物質吸收途徑和植物的絲裂原活化蛋白激酶信號途徑、植物-病原體相互作用、磷脂酰肌醇信號系統、植物激素信號轉導、肌醇磷酸代謝、卟啉和葉綠素代謝。

綜和以上試驗結果，根據差異蛋白的表達量、分子功能、代謝通路的生物信息學分析結果，篩選出28個目標差異蛋白，見表3。

與中寧產區的樣品相比，格爾木產區樣品的3種不同類型的鐵蛋白Ferritin的表達量都是上調的或者只在格爾木產區樣品中檢測到。鐵蛋白Ferritin在自然界的動物、植物、微生物等生命體中都普遍存在，它能夠起到貯存Fe元素和生物礦化蛋白的作用。經李紅英等[15]測定格爾木產區枸杞的Fe元素含量是110.6 μg/g，中寧產區枸杞的Fe元素含量是78.82 μg/g；任永麗等[16]測定格爾木產區枸杞的Fe元素含量是110.60 μg/g，中寧產區枸杞的Fe元素含量是78.71 μg/g，兩篇文獻的數據基本一致，且和蛋白質組學KEGG代謝途徑的分析結果基本符合，即中寧產區枸杞比格爾木產區枸杞含Fe量低。

圖3 KEGG的分析結果Fig.3 KEGG analysis results

與中寧產區的樣品相比較，ATX1銅伴侶蛋白在格爾木產區樣品中的表達量是下調的。ATX1是一種有優異螯合活性的在胞內作用的一價銅離子Cu+金屬伴侶蛋白[17-19]，并且其后續代謝途徑有利于銅離子更快排出植物體外。李紅英等[15]的試驗結果表明中寧產區枸杞的Cu元素含量是17.55 μg/g，格爾木產區枸杞的Cu元素含量是24.08 μg/g；任永麗等[16]的試驗結果是中寧產區枸杞的Cu元素含量是17.45 μg/g，格爾木產區枸杞的Cu元素含量是24.01 μg/g，兩篇文獻的數據十分接近，且與蛋白質組學的分析推斷一致。

表3 差異蛋白質列表Table 3 Differential protein list

在6個熱休克蛋白中，Hsp90A、Heat shock protein 90-1、Molecular chaperone Hsp90-1在中寧樣品中的表達量較高，而 Heat shock protein 90-6、Hsp90B、Molecular chaperone Hsp90-2則只在格爾木樣品中檢測到。Hsp90系列的熱休克蛋白是一種分子伴侶，能夠起到穩定和保護激酶、類固醇等底物蛋白質的作用[20-21]。從枸杞的生長條件來看，中寧產區和格爾木產區的溫度、土壤條件、對植物有危害的病原體等外界條件的差別，會造成兩產地枸杞的熱休克蛋白表達量存在差異。

3個幾丁質酶中，30 kDa內切殼多糖酶在格爾木樣品中的表達量與中寧樣品相比是上調的；類幾丁質酶（Class I chitinase）、29 kDa幾丁質類熱滯蛋白（片段）是只在格爾木樣品中檢測到的。幾丁質酶在植物中能起到抗凍、抗病蟲害的作用[22]。

核糖核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase）在中寧樣品中的表達量高于格爾木樣品。該酶是植物實現對病原體免疫的MAPK信號途徑的關鍵酶，它能促使防衛蛋白基因表達[23]。

過氧化氫酶CAT2在中寧樣品中的表達量高于格爾木樣品，部分過氧化氫酶的片段在中寧樣品中的表達量低于格爾木樣品。過氧化氫酶的作用是清除植物體內過多的過氧化氫[24]。

與磷酸肌醇代謝途徑和磷脂酰肌醇信號系統有關的4個差異蛋白質中，磷酸丙糖異構酶（葉綠體）（Triosephosphate isomerase，chloroplastic） 在中寧樣品中的表達量比格爾木樣品高；兩種不同的1，3，4-三磷酸肌醇 5/6-激酶（Inositol-1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase，ITPK），登錄號為A0A2G2WMD3在格爾木產區樣品中的表達量較高，而登錄號為M0ZU90的磷酸激酶僅在中寧樣品中檢出；肌醇-1-磷酸合成酶（Myo-inositol-1-phosphate synthase）在中寧樣品中的表達量高于格爾木樣品。

在3種植物激素調節酶中，油菜素內酯信號激酶（BSK BR-signaling kinase）在中寧樣品中的表達量高于格爾木樣品，油菜素內酯是一種重要的植物激素，在調節細胞增殖和形態生長、植物體的頂端優勢、葉片和葉綠體程序性衰亡等生命活動中起關鍵作用，同時也與植物的抗逆性有關[25-26]；組氨酸磷酸轉移蛋白1（Histidine-containing phosphotransfer protein 1）和雙組分響應調節器（Two-component response regulator）是只在中寧產區樣品中檢測到的蛋白質。

在卟啉和葉綠素代謝途徑中，脫鎂葉綠酸加氧酶（pheophorbide A oxygenase，PAO）是下調蛋白質；紅葉綠素分解代謝物還原酶（Red chlorophyll catabolite reductase）、線粒體型共濟失調蛋白抗體（Frataxin）、尿卟啉原脫羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase）、鎂-原卟啉IX單甲酯（氧化）環化酶[Magnesium-protoporphyrin IX monomethyl ester（oxidative）cyclase]是只在格爾木樣品中檢出的蛋白質。從卟啉和葉綠素代謝途徑相關的差異蛋白來看，中寧產地和格爾木產地的枸杞在葉綠素的合成和代謝能力上存在差別。

3 結論

本文通過lable-free技術對中寧和格爾木兩產區的寧杞一號枸杞果實進行了蛋白質組學的分析，檢測到了兩產地枸杞果實中的差異蛋白質。通過對兩產區枸杞果實的差異蛋白質進行生物信息學分析得出結論：從金屬離子轉運蛋白的角度證實了中寧產區的樣品Fe、Cu兩種元素的含量均明顯低于格爾木產區的樣品，可以通過大量檢測兩地樣本積累數據得出利用金屬元素含量判斷寧杞一號干果產地的標準；對熱休克蛋白、幾丁質酶、核糖核苷二磷酸激酶和過氧化氫酶的分析說明了兩產地寧杞一號的蛋白質表達差異在很大程度上是由于兩產地不同的氣候、土壤壞境以及對植物有害的病原體所引起的；油菜素內酯信號激酶的表達量差異會引起兩產地枸杞干果的形態學差異，推測可以通過機器視覺技術實現兩產地寧杞一號干果的鑒別；卟啉和葉綠素代謝途徑中的蛋白質差異說明兩產地枸杞果實中的色素含量存在差別。由于目前對磷酸肌醇轉化酶和高等植物雙組分調節機制的研究還不夠深入，很難在這兩個方面解釋兩產地枸杞樣品的差異。本研究可為鑒別不同產地寧杞一號枸杞果實提供蛋白質組學水平的科學依據。