ApoA-Ⅰ模擬肽抗動脈粥樣硬化的研究進展

賀春霞，李慧瑾，秦 魏，邢 露，周 鑫，趙 棟，李鵬權，金 曦，曹慧玲

(陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室，西安醫學院基礎與轉化醫學研究所，陜西 西安 710021)

心腦血管疾病是全球人類的首要殺手，動脈粥樣硬化 (atherosclerosis，As) 是其主要病理基礎，高血脂導致的脂質代謝紊亂，是引發As的獨立危險因素[1]。高密度脂蛋白 (high density lipoprotein，HDL) 是脂代謝過程中的五大載脂蛋白之一，其功能主要是參與膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport，RCT)，即將外周組織中的膽固醇逆轉運至肝臟，轉化為膽汁酸或合成類固醇激素，促進膽固醇代謝，是機體排出多余膽固醇的唯一途徑。同時，HDL可通過抗炎、抗氧化作用，維持內皮細胞完整性，保護內皮功能。因此，HDL在As發生發展中發揮重要保護作用，作為As和冠心病的保護因子受到廣泛重視，以升高血液HDL水平為治療策略的抗As藥物開發一度成為熱點。但是，煙酸受體激動劑和膽固醇酯轉移酶抑制劑類藥物研發的相繼失利，提示單純升高血液HDL為治療策略抗As似乎不可行[2]。

HDL由載脂蛋白、膽固醇與調節因子組成，其載脂蛋白包括ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅱ，其中ApoA-Ⅰ是HDL的主要蛋白質成分，約占其蛋白質含量的70%。ApoA-Ⅰ在RCT中發揮關鍵作用[3]，與As和冠心病發生呈負相關，是As與冠心病最重要的保護因素之一。靶向ApoA-Ⅰ研發的模擬肽，基于重組ApoA-Ⅰ研發的ApoA-Ⅰ米蘭和HDL模擬肽表現出良好的促RCT與抗As作用，作為有潛力的抗As藥物而備受關注。本文從ApoA-Ⅰ的結構和功能，ApoA-Ⅰ與ABCA1 (ATP-binding cassette transporter A1)、LCAT (lecithin cholesterol Acyl transferase)與SR-B1 (scavenger receptor class B member 1) 分子互作機制，靶向ApoA-Ⅰ類模擬肽抗As活性等方面進行了綜述，以期為ApoA-Ⅰ模擬肽類抗As新藥研發提供參考。

1 ApoA-Ⅰ的結構與功能

1.1 ApoA-Ⅰ的結構目前研究熱點主要集中在盤狀和球狀HDL結構上，對于ApoA-Ⅰ結構研究甚少。ApoA-Ⅰ由267個氨基酸組成，氨基酸1-18構成信號肽，氨基酸19-267稱作ApoA-Ⅰ前體，由243個氨基酸 (25-267) 構成的肽段稱為成熟ApoA-Ⅰ，是構成HDL的主要成分[4]。

在成熟ApoA-Ⅰ中，推測氨基酸1-43的肽段負責蛋白間互作，其余氨基酸構成10個串聯α螺旋，其中兩個α螺旋由11個氨基酸構成，另外8個α螺旋由22個氨基酸構成，為脂質結合區，決定了盤狀HDL的直徑 (Tab 1)[5]。ApoA-Ⅰ在體內有不載脂、少載脂和載脂3種存在形式。Mei等[6]采用X-射線衍射法研究ApoA-Ⅰ的結構發現，C端 (氨基酸185-243) 可形成一個半圓二聚體，該二聚體骨架由兩個反向平行的由脯氨酸連接的5個縱向AB型螺旋構成，而N端與之相對應區域形成四個螺旋束，中心彈性區域由兩個反向平行的螺旋 (helix5/5)構成。基于這項研究，Gursky[7]提出了HDL的“雙帶模型”：雙帶中心部分是氨基酸66-184構成結構保守的恒定區，而N端氨基酸1-65和C端氨基酸185-243為可變區，在HDL成熟過程中可發生重排。隨著雙帶周圍包含氨基酸G65-P66和G185-G186鉸鏈的擺動，這些鉸鏈區對應不同大小的DHL顆粒，與N-端結合的包含氨基酸G39與G65兩個柔韌區逐漸解離，帶逐漸延長，賦予HDL二維表面曲率到球型表面。而ApoA-Ⅰ的這一結構特征與不同大小HDL的形成密切相關。Kontush等[4]提出每個HDL球形粒子可包含3-5個ApoA-Ⅰ分子，并進一步建立了不同大小HDL球形粒子的模型 (Fig 1)。

Tab 1 The functional segments in ApoA-Ⅰ

隨后，Mei等[8]又研究了ApoA-Ⅰ C端結構發現，helix10 可能負責脂質結合與聚集啟動，膽固醇外排，在HDL形成過程中發揮至關重要作用。Ray等[9]研究發現，在ApoA-Ⅰ中加入生理濃度膽固醇后，由C端特定膽固醇結合位點和N端新膽固醇結合位點驅動的劇烈結構擾動，促使單體蛋白自發形成圓形構象。由此推測，ApoA- I以階段性方式打開，結構變化是由特定膽固醇與ApoA-Ⅰ互作導致，而不是非特異疏水效應引起。由此可見，C端結構域對于ApoA-Ⅰ與脂質結合啟動、驅動HDL形成具有重要作用。

1.2 ApoA-Ⅰ的功能

1.2.1ApoA-Ⅰ在RCT中的作用 HDL最主要功能是參與RCT，HDL代謝過程實質是由ApoA- I與其他脂蛋白參與的脂質運輸和代謝過程。首先，膽固醇和其他脂質通過ABCA1與空載ApoA-Ⅰ結合，形成包含兩個ApoA-Ⅰ拷貝的盤狀HDL，然后LCAT結合到ApoA-Ⅰ使膽固醇酯化，使盤狀HDL變為成熟球形HDL。最后，HDL攜帶脂質通過肝HDL受體SR-B1清除，剩下空載ApoA-Ⅰ (Fig 2)。因此，ApoA- I不僅是脂質和膽固醇在親水環境中的穿梭支架，同時也是HDL成熟與脂蛋白顆粒間通訊的錨定中心[10]。

Fig 1 Development of trefoil model for a spherical particle from double belt of ApoA-Ⅰ

Fig 2 Diagram of ApoA-Ⅰ removing cholesterol by RCT

1.2.2ApoA-Ⅰ的抗炎作用 在新西蘭白兔頸動脈急性炎癥造模后，單次低劑量灌注ApoA-Ⅰ可減少中性粒細胞浸潤，抑制中性粒細胞活化[11]。ABCA1和ABCG1 受體缺失小鼠的白細胞明顯增多，且出現了可移植的骨髓增生性疾病，ApoA-Ⅰ過表達可抑制該現象，表明ApoA-Ⅰ具有抗炎作用，可抑制炎性反應[12]。研究表明，ApoA-Ⅰ可通過多種機制發揮抗炎作用。如ApoA-Ⅰ可以通過ABCA1，減少脂質筏豐度，降低CD11b表達水平，從而抑制中性粒細胞的激活、遷移和粘附。另一種抗炎機制指出，ApoA-Ⅰ/HDL可降低巨噬細胞炎性小體成分表達，如 NLRP3 (NLR family pyrin domain containing 3)、IL-1以及caspase 1，發揮抗炎作用[12]。

1.2.3ApoA-Ⅰ在抗氧化、細胞增殖等方面的作用 Miroshnichenko等[13]研究了ApoA-Ⅰ在有害條件 (饑餓、缺氧條件和H2O2氧脅迫)下對骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs) 存活和增殖率的影響。首次發現ApoA-Ⅰ可降低細胞內活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)，促進MSCs增殖，增加氧化條件下的細胞數量。缺氧條件下，MSCs處于G0/G1期時，ApoA1不影響其細胞周期，在MSCs向充氧或氧化狀態過渡時，ApoA-Ⅰ可快速激活細胞增殖，減少細胞凋亡。ApoA-Ⅰ可在各種不利條件下保護細胞，提高Ⅱ型糖尿病 (T2D) 患者MSCs的移植效率。提示ApoA-Ⅰ具有抗氧化和促進MSCs細胞增殖活性，在糖尿病預防和治療方面也具有開發潛力。

2 ApoA-Ⅰ的分子互作機制

2.1 ApoA-Ⅰ與ABCA1互作在RCT過程中，ApoA-Ⅰ載脂的起始需要ABCA1輔助，是RCT的限速步驟。ABCA1可將脂質轉運給多種參與HDL形成的脂蛋白，如ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅱ、ApoC、ApoE-3、ApoE-4[14]。ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅰ模擬肽5A可動員ABCA1+/+巨噬細胞沉積的膽固醇微區，而無法動員ABCA1-/-巨噬細胞沉積的膽固醇微區，說明這種動員依賴于巨噬細胞ABCA1，而一旦ApoA-Ⅰ模擬肽5A與磷脂復合，即使在沒有ABCA1的情況下，也可動員巨噬細胞沉積的膽固醇微區。說明ABCA1對于啟動ApoA-Ⅰ載脂至關重要[15]。研究表明，缺乏helix 10的ApoA-Ⅰ截短體無法促進膽固醇外排，線性陣列排列的兩親性α螺旋是促進ABCA1膽固醇外流所所必需的結構原件[16]。但空載ApoA-Ⅰ是如何獲取來自ABCA1轉運的游離膽固醇和磷脂來啟動球形HDL形成，ApoA-Ⅰ與ABCA1的分子互作機制還有待進一步研究。

2.2 ApoA-Ⅰ與LCAT互作ApoA-Ⅰ對LCAT的活化具有重要作用。Cooke等[17]研究發現，完整的LCAT活性需要一個ApoA-Ⅰ分子上的helix5-7和另一個ApoA-Ⅰ分子上的helix3-4組成的雜交表位。提示ApoA-Ⅰ helix3-7對LCAT催化膽固醇酯化過程具有重要作用。在上文提到的“雙帶模型”中，兩個反向平行的ApoA-Ⅰ分子通過helix5/5形成一個與脂質結合的通道，這個通道兩端有兩個帶正電的精氨酸R123。Gorshkova等[18]提出，這兩個特殊定位的精氨酸R123直接參與了LCAT催化膽固醇酯化過程。基于此假設，Gorshkova等制備了R123A與R123E的ApoA-Ⅰ突變體，研究表明，雖然R123突變沒有改變HDL顆粒組成和大小，也沒有改變蛋白質構象和穩定性，但是，R123的兩種突變均顯著降低了LCAT的催化效率和膽固醇酯形成的表觀Vmax，對LCAT磷脂水解無影響。可見ApoA-Ⅰ在盤狀高密度脂蛋白上的R123對LCAT介導的膽固醇酯化反應催化效率具有重要作用。

2.3 ApoA-Ⅰ與SR-B1互作LCAT催化HDL-膽固醇酯化，形成成熟的球狀HDL，而后HDL-膽固醇酯可被肝臟清道夫受體SR-B1攝取，使膽固醇酯在肝臟內進一步代謝，排出體外[10]。SR-B1是跨膜蛋白，包含1個高糖基化的胞外結構域和2個胞內尾巴，胞外結構域由兩個跨膜結構域錨定在細胞膜上。為了促進膽固醇運輸，HDL和SR-B1必須形成一種特定“復合物”，HDL以精確構象與SR-B1胞外結構結合，實現高效脂質運輸，而ApoA-Ⅰ helix4-6對于該過程具有重要作用[19]。最近關于SR-B1結構研究顯示，SR-B1的C端跨膜結構域含有1個亮氨酸拉鏈結構，當其發生突變時，會削弱受體與HDL結合及其介導的膽固醇傳遞能力，這與SR-B1不能形成二聚體有關，同時還發現SR-B1胞外結構域的近膜區可能與脂質表面相互作用，促進SR-B1的膽固醇轉運功能[20]。

3 靶向ApoA-Ⅰ的模擬肽ApoA-Ⅰ是HDL的主要成分，是膽固醇的重要載體，血漿HDL從外周組織接收游離膽固醇，在LCAT催化下轉變成膽固醇酯。同時，ApoA-Ⅰ還是HDL受體的配體，可觸發膽固醇酯向肝細胞轉運和代謝。基于ApoA-Ⅰ在膽固醇代謝中的重要作用，ApoA-Ⅰ一直是抗As藥物研發的研究熱點。然而，由于高昂的人工合成成本以及缺乏口服給藥方式，ApoA-Ⅰ本身作為藥物制劑的開發受到嚴重限制。所幸，以ApoA-Ⅰ為靶標開發的ApoA-Ⅰ模擬肽和ApoA-Ⅰ Milano表現出良好的促RCT與抗As作用，作為有潛力的抗As藥物而備受關注。

3.1 ApoA-Ⅰ模擬肽α螺旋是ApoA-Ⅰ發揮功能的結構基礎，因此，科學家們模擬ApoA-Ⅰ的α螺旋合成了不同氨基酸組成的α螺旋模擬肽(Tab 2)。18A是人工設計合成的第一個ApoA-Ⅰ單α螺旋模擬肽，該18A肽具有疏水氨基酸 (W，L，A，F，Y，V)，在極性表面具有親水性氨基酸 (D，E，K，R)，在極性/非極性界面上有帶正電荷的賴氨酸，在極性面中心有帶負電的D或E。在18A基礎上，科學家們進一步設計了F系列單α螺旋模擬肽以及基于兩個18A的雙螺旋模擬肽，如37pA等。幾種小鼠模型研究發現，模擬肽6F具有抗氧化和抗炎特性，用表達6F的轉基因番茄喂養LDLR-/-小鼠，治療13 W后，與對照相比，改善了炎癥和抗氧化的系列生物標志物，顯著降低了主動脈病變面積[21]。5A是在37pA基礎上改良ApoA-Ⅰ模擬肽，細胞毒性較低，可通過ABCA1特異性地誘導膽固醇外排，具有抗炎和抗氧化特性，5A還可減少哮喘小鼠模型中的氣道炎癥[22]。ATI-5261是Bielicki等人開發的一種由36個氨基酸組成的肽，可形成一個具有雙親性的單螺旋結構，可誘導ABCA1介導的膽固醇外排。與安慰劑組相比，經ATI -5261治療的小鼠主動脈病變面積和斑塊脂質含量顯著降低，同時隨糞便排泄甾醇增加，表明在ATI-5261治療促進RCT，促進了膽固醇排泄[23]。目前，ApoA-Ⅰ模擬肽ETC-642、L-4F和D-4F進入了臨床Ⅰ期試驗。研究表明，其具有良好的安全性和耐受性。4F的兩個臨床實驗由于在保護LDL誘導的單核細胞趨化性的結果上相矛盾，諾華公司終止了4F的進一步研究。ETC-642是一種由22個氨基酸肽組成的復合物，它可形成一個雙螺旋結構，研究發現，ETC-642具有良好的促進膽固醇外排，抗炎和抑制斑塊形成的作用[24]。

Tab 2 ApoA-Ⅰ mimic peptide

PeptideCholesterolefflux 35ELK-1AEKLKELLEKLLAKLKELL-P-EKLKELLEK-LLAKLKELL22c36ELK-1FEKFKELLEKLLEKLKELL-P-EKFKELLEK-LLEKLKELL50c37ELK-2A2K2EEKLKAKLEELKAKLEELL-P-EKLKAK-LEELKAKLEELL75c38ELK-3E3EKEELKELLKELLKKLEKLL-P-ELKELLKELLKKLEKLL84c39ELK-2E2KEELKKLLEELLKKLKELL-P-EE-LKKLLEELLKKLKELL69c40ELK-PAEKLKELLEKLLEKLKELL-A-EKLKELLEK-LLEKLKELL38c41ELK-P2AEKLKELLEKLLEKLKELL-AA-EKLKELLE-KLLEKLKELL65c42ELKAEKLKAKLEELKAKLEELL-P-EKAK-AALEEAKAKAEELA0c43ELKA-CH2EKLKAKLEELKAKLEELL-P-EHA-KAALEEAKCKAEELA0c445A-CH1DHLKAFYDKVACKLKEAF-P-DWA-KAAYDKAAEKAKEAA0c455A-CH2DWLKAFYDKVAEKLKEAF-P-DHA-KAAYDKAACKAKEAA61c465A-C1DWLKAFYDKVACKLKEAF-P-DWA-KAAYNKAAEKAKEAA34c475A-H1DHLKAFYDKVAEKLKEAF-P-DWA-KAAYDKAAEKAKEAA48c

目前，模擬肽功能研究包括體內和體外研究。體內功能研究主要是利用模型動物如高脂血癥家兔、LDLR-/-小鼠、ApoE-/-小鼠等進行高脂飲食造模，然后通過腹腔注射藥物來檢測主動脈病變面積、斑塊脂質含量以及糞便甾醇外排等。體外功能研究主要是細胞毒性、膽固醇外排、抗炎抗氧化作用評價等，目前尚無統一評價標準。D’souza等研究了22種不同雙螺旋ApoA-Ⅰ模擬肽 (17種ELK模擬肽和5種5A模擬肽) 對膽固醇外排能力和特異性，對單核細胞和內皮細胞炎癥反應的抑制作用，對LDL氧化的抑制作用。結果表明，沒有一種模擬肽在所有抗As功能的各方面都表現優良，不同抗As功能主要受特定結構特征的影響。平均疏水性、電荷量、疏水面大小和螺旋間連接角度是決定膽固醇流出效率和特異性的主要因素，疏水表面電荷和大小是影響抗炎性能的主要因素，半胱氨酸和組氨酸的存在是決定抗氧化性能的主要因素[25]。ApoA-Ⅰ模擬肽的構效關系研究，對于ApoA-Ⅰ模擬肽設計和改造具有重要指導意義。

3.2 基于重組ApoA-Ⅰ的HDL模擬肽除了上述基于ApoA-Ⅰ α螺旋研發的模擬肽，利用重組ApoA- I和磷脂類脂質組成的HDL模擬肽也取得了一定進展(Tab 3)。ApoA-Ⅰ Milano是一種人源的自然突變，該突變攜帶者特征是HDL-C水平降低，而沒有預期的CVD風險增加。與ApoA-Ⅰ相比，ApoA-Ⅰ Milano可誘導更多ABCA1介導的膽固醇外排，同時還具有優良的抗炎和斑塊穩定特性[38]。動物模型證實，ApoA-Ⅰ Milano短期灌注，可促進As斑塊消退[26]，由此研發的ETC-216已進入二期臨床實驗。在II期臨床試驗中，在急性冠脈綜合征 (ACS) 后的一小群患者中，應用ETC-216后，采用血管內超聲 (IVUS) 檢測發現，冠狀動脈粥樣硬化顯著消退。但是，嚴重免疫刺激副作用阻礙了對ETC-216的進一步評價研究。MDCO-216，一種ETC-216改良肽，可消除不良免疫刺激，但其對動脈粥樣斑塊的治療效果也大大減弱[27]。目前尚無對ApoA-Ⅰ Milano的進一步研究報道。CSL-112是一種由ApoA-Ⅰ和磷脂組成的重組HDL，其前體分子CSL-111由于高肝毒性而暫停研究。CSL-112的一期和二期臨床研究已經完成，結果表明，其可顯著增強膽固醇外流，具有良好耐受性，無明顯臟器毒性或免疫原性，目前已進入三期臨床研究[28]。CER-001是一種初生HDL模擬肽，由重組ApoA-Ⅰ和雙磷脂酰甘油及鞘磷脂兩種磷脂組成，CER-001對于冠狀動脈粥樣硬化患者的改善作用具有劑量依賴性，表現為U型劑量曲線，建議使用3 mg·kg-1劑量。在家族性低α蛋白血癥患者中應用已進入三期臨床試驗[29-30]。

Tab 3 ApoA-Ⅰ based reconstituted HDL mimics

4 結語

ApoA-Ⅰ作為HDL的主要蛋白成分，在RCT過程中發揮關鍵作用。雖然目前尚無成熟藥物上市，但基于ApoA-Ⅰ結構和功能研發的模擬肽類藥物表現出良好的促RCT與抗As活性，具有廣闊的開發和應用前景。由于ApoA-Ⅰ單體及HDL不同成熟階段的結構尚未解析，基于結構與功能的研究還有待進一步完善。不同成熟階段HDL與其載脂的分子作用機制尚不明確，導致ApoA-Ⅰ類模擬肽主要集中在表型功能方面的研究，缺乏藥物作用分子機制探索，給ApoA-Ⅰ類模擬肽藥物研發推進帶來一定困難。同時，目前也有基于ABCA1、LCAT和SR-B1等與HDL互作機制的藥物研發，也面臨類似困難。此外，對于ApoA-Ⅰ類模擬肽類藥物，缺乏科學全面的藥效評價體系，有待深入研究解決。未來隨著ApoA-Ⅰ和HDL結構和功能的深入研究，RCT相關分子互作機制的深入闡釋，必將促進基于ApoA-Ⅰ結構和功能的模擬肽類抗As藥物研發，造福人類健康。