p300在老年小鼠心房顫動易感性中的作用研究

彭德威，周慧珊，劉海燕，高小燕，賴穎瑜,3，李巧巧，鄧春玉，楊 慧，鄺素娟，薛玉梅，吳書林，饒 芳

(1.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006；2.廣東省心血管病研究所心內科，廣東省人民醫院醫學研究部，廣東省醫學科學院，廣東 廣州 510080；3.南方醫科大學藥學院，廣東 廣州 510515)

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，可導致中風和心力衰竭等并發癥，嚴重影響患者的生存[1-2]。衰老是房顫的獨立危險因素，房顫發病率隨著年齡的增長而增加[3]。在60-65歲的人群中發生房顫的比例不到1%，而80歲以上人群則高達8%-10%[4]。但衰老在房顫發病機制中的作用尚未闡明。

心房肌細胞電重塑是房顫的主要病理機制之一，其主要標志是心房有效不應期縮短，頻率適應性喪失和心房傳導延長。心房肌細胞鈣蓄積，使內向L型鈣電流(L-type calcium channel current，ICa,L)減少，導致心房有效不應期縮短和多子波-折返通路形成和維持，進而導致房顫的發生和發展。研究發現，衰老心臟的心房肌細胞ICa,L減少，心房有效不應期縮短，并出現心肌肥大和凋亡，心房纖維化等病理改變，房顫易感性增加[5]。但目前關于衰老導致房顫的具體分子機制研究較少。

轉錄輔激活因子p300是細胞信號轉導的橋梁，參與調控細胞周期、分化和凋亡[6]。研究表明，在人肺成纖維細胞中，p300是復制性衰老表型的主要驅動力，抑制p300可延緩復制性衰老的進程[7]。在小鼠心衰模型中，p300通過乙酰化Ca2+-ATP酶SERCA2a并抑制其功能，引起細胞內鈣離子穩態失衡從而導致心肌功能障礙[8]。但p300是否通過調控ICa,L，在衰老相關心房肌細胞電重塑中發揮重要作用，目前尚無相關研究報道。本研究旨在探討p300在調控老年心房肌細胞電重塑中的作用，為臨床上衰老相關房顫的防治提供新策略。

1 材料

1.1 動物由廣東省廣州中醫藥大學實驗動物中心提供的SPF級C57BL/6雄性小鼠，分別是5、13和18月齡，許可證號為SCXK(粵)2013-0034。部分18月齡小鼠隨機分組，分別給予低劑量(50 mg·kg-1·d-1，n=10)和高劑量(100 mg·kg-1·d-1，n=10)的姜黃素飼養。本研究所有的動物實驗已通過廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院)動物實驗倫理審查(No GDREC2016128A)。

1.2 主要試劑與儀器抗p300抗體(Millipore)；抗Cav1.2抗體(Alomone)；抗p53抗體(Cell Signaling Technology)；抗p21抗體(Santa Cruz)；GAPDH抗體 (Cell Signaling Technology)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(Invitrogen)；硝酸纖維素膜PVDF膜(Millipore)；Langendorff 恒流灌流裝置；姜黃素(Cayman)；4×蛋白上樣緩沖液(Bio-RAD)；RIPA裂解液(Beyotime)。實驗設備包括恒溫水循環灌流裝置(Narishige,Japan)，P97拉制儀(Sutter,America)，MultiClamp 700B膜片鉗放大器及附件(Axon,America)。

2 方法

2.1 小鼠心房快速起搏稱取小鼠體質量，腹腔注射3%(30 mg·kg-1)戊巴比妥鈉。將小鼠仰位固定于實驗臺上，使用小動物溫控加熱墊監測溫度并將其保持在(37-38) ℃之間。備皮、局部消毒。將鉑金針刺電極連接到小鼠的四肢，使用iWorx數據采集和分析系統對小鼠心電圖進行記錄和分析，連續記錄Ⅰ和Ⅱ導聯心電圖。頸部正中切口，鈍性分離右側頸靜脈，結扎遠心端。血管中段穿過兩根手術線備用，血管夾夾閉近心端。在右側頸靜脈作小切口，置入鞘管，固定近心端。在心腔內心電圖和體表心電圖監測下沿鞘管送入電極導管，松開近心端血管夾，將心電導管送入右心房。

以1 ms的起搏脈寬，比基礎心率快10 beat·min-1的起搏頻率進行起搏閾值測定。以心腔內心電圖出現高大A波小V波為理想的記錄圖。電極導管放置到位，以確保獲得恒定的心房奪獲并達到最小起搏閾值，固定電極導管。采用心房爆發式起搏(Burst)模式，設置刺激幅度為2倍的起搏閾值，刺激脈寬為1 ms，進行15 s的起搏，實驗重復10次。觀察并記錄AF的持續時間和發作次數。AF定義為心房無序的電活動，心電圖表現為P波消失，代之以大小不等間隔不均，形態不一的f波，RR間期不等，持續1 s以上。AF誘發率定義為成功誘發AF的次數與總誘發次數的比值。AF持續時間定義為每只小鼠自AF誘發起始到AF自然終止之間的時距。

2.2 全細胞膜片鉗記錄使用Langendorff恒流灌流裝置分離小鼠單個心房肌細胞，6 h之內用于電生理實驗。記錄ICa,L的細胞外液成分(mmol·L-1)：CsCl 100,TEA-Cl 20,Na2-ATP 5,Na2GTP 0.4,EGTA 10，HEPES 10,用Tris將pH調至7.2。記錄ICa,L的細胞內液成分(mmol·L-1)：Choline-Cl 126，CsCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,NaH2PO4·2H2O 0.33,Glucose·H2O 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 2，用CsOH將pH調至7.4。記錄AP的細胞外液成分(mmol·L-1)：NaCl 136,KCl 5.4,MgCl2·6H2O 1,D-glucose 10,HEPES 10,CaCl2·2H2O 1.8，NaH2PO4·2H2O 0.33，用NaOH將pH調至7.4。記錄AP的電極內液成分(mmol·L-1)：KCl 140,MgCl2·6H2O 1,HEPES 10,EGTA 5 and Na2-ATP 5，KOH使pH調至7.2。

采用兩步法拉制玻璃電極，灌注電極內液后排出氣泡，置于推進器上，控制電極尖端電阻為(2-5) MΩ。高阻封接(阻抗>1 GΩ)后，予負壓破膜形成穩定的全細胞狀態，電容及電阻補償后，形成全細胞記錄。使用Digidata 1 440 A低噪聲數據采集系統，通過MultiClamp 700B(Axon公司，美國)放大器記錄信號。使用電壓鉗模式測量并記錄ICa,L和膜電容(membrane capacitance，Cm)，電流鉗模式測量并記錄AP。使用pCLAMP 10.5軟件控制命令電位和數據采集。使用Clampfit 10.4軟件對單個全細胞記錄進行數據測量。在形成全細胞狀態后，將細胞鉗制在-40 mV，緊接著施于從-50-+50 mV，步階電壓為10 mV，波寬為300 ms，頻率為0.2 Hz的刺激，記錄ICa,L。以峰電流(pA/pF)對膜電位作圖，即得I-V曲線。

3 結果

3.1 不同月齡小鼠心房組織p300、離子通道和衰老相關蛋白的表達收集不同月齡(5、13和18月齡)C57BL/6小鼠左心耳組織，Western blot檢測組織中p300，L型鈣離子通道Cav1.2，衰老相關蛋白p53和p21的表達。結果顯示，與5月齡小鼠相比，13月齡和18月齡小鼠左心耳p300表達增加(0.73±0.18 in 5月齡vs1.14±0.23 in 13月齡，1.07±0.18 in 18月齡,P<0.01,n=6)，Cav1.2表達減少(1.02±0.30 in 5月齡vs0.74±0.20 in 13月齡,P<0.05；0.58±0.08 in 18月齡,P<0.01,n=6)，衰老相關蛋白p53和p21明顯增加(p53：0.53±0.17 in 5月齡vs0.94±0.14 in 13月齡，P<0.01；0.72±0.22 in 18月齡,P<0.05；p21:0.56±0.16 in 5月齡vs1.06±0.23 in 13月齡,P<0.01；0.98±0.21 in 18月齡,P<0.01,n=6)。提示13月齡和18月齡小鼠左心耳組織p300表達明顯增加，衰老相關蛋白表達增加，而L型鈣通道蛋白表達減少(Fig 1)。

Fig 1 The protein expression of p300,Cav1.2,p53 and p21 in atrial tissues of C57BL/6 mice at different ages (,n=6).*P<0.05,**P<0.01 vs 5 m group.

3.2 不同月齡小鼠心房肌細胞ICa,L和APD體外分別分離5月齡和18月齡C57BL/6小鼠左心耳單個心房肌細胞，膜片鉗技術檢測心房肌細胞ICa,L和動作電位時程(action potential duration，APD)。結果顯示，與5月齡的小鼠相比，18月齡小鼠左心耳心房肌細胞ICa,L的峰值電流密度明顯減少(在峰值電壓+10 mV時，分別是(-1.84±0.42) pA/pFvs(-1.16±0.32) pA/pF，P<0.01，n=10-11)(Fig 2A、2B)，APD90(78.04±16.52 msvs38.28±5.56 ms)、APD70(44.2±11.77 msvs23.19±5.77 ms)、APD50(23.90±6.78 msvs14.22±5.08 ms)均明顯縮短(P<0.01，n=9-10)(見Fig 2C)，動作電位幅度(action potential amplitude,APA)無統計學意義(P>0.05)。

3.3 不同月齡小鼠快速心房起搏刺激房性心律失常的可誘發性5月齡和18月齡C57BL/6小鼠分別予經頸靜脈心房快速起搏，觀察房性心律失常的可誘發性。與5月齡小鼠相比，15 s心房爆發式起搏后18月齡小鼠的AF誘發率明顯升高(4%vs14.3%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.4 姜黃素處理可降低老年組小鼠房顫可誘發性以不同劑量姜黃素(50、100 mg·kg-1·d-1，6個月)飼養小鼠至18月齡，予以經頸靜脈心房快速起搏，觀察姜黃素對老年小鼠AF可誘發性的影響。結果發現，與18月齡小鼠相比，不同劑量的姜黃素處理均可使18月齡小鼠的AF誘發率降低(18月齡組vs低劑量組，14.3%vs1.36%,P<0.01；高劑量組為1.19%，P<0.01)(Fig 3B)。

3.5 姜黃素處理老年組小鼠可逆轉其心房電重塑分離對照組和不同劑量姜黃素處理的18月齡小鼠的左心耳單個心房肌細胞，膜片鉗技術檢測相應的ICa,L和APD。結果顯示，姜黃素可使老年組小鼠心房肌細胞降低的峰值電流密度明顯恢復(在峰值電壓+10 mV時，18月齡組vs低劑量組,(-1.16±0.32) pA/pFvs(-2.04±0.42) pA/pF，P<0.01；高劑量組為(-1.54±0.37) pA/pF，P<0.01,n=10-13)(Fig 4A、4B)。且與對照組相比，低劑量姜黃素處理組小鼠左心耳細胞APD90(38.28±5.56 msvs64.53±17.28 ms，P<0.01)、APD70(23.19±5.77 msvs37.29±10.52 ms，P<0.01)、APD50(14.22±5.08 msvs20.76±6.71 ms，P<0.05)延長(n=9-10)(Fig 4C)，動作電位幅度(action potential amplitude，APA)差異無統計學意義(P>0.05)。提示姜黃素能改善老年小鼠心房肌細胞的電重塑。

Fig 2 ICa,L and APD in 5 m and 18 m C57BL/6 mice groups()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes from 5 m and 18 m C57BL/6 mice [n=10-11/3-4(atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L in above groups[n=10-20/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes in above groups [n=9-10/3-4(atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50were calculated.**P<0.01 vs 5 m group.

Fig 3 AF incidence induced by rapid atrial pacing in 5 m,18 m mice with or without curcumin treatmentA：Typical surface ECG and intra-atrial electrocardiogram (IAEG)；B：AF incidence in 5-month old，18-month old with or without curcumin treated mice(n=10/8/8/9,respectively).**P<0.01 vs 5-month-old mice;##P<0.01 vs 18-month-old mice.(C) Typical surface ECG recordings in mice with AF that spontaneously reverted to SR.(D) Disorganized atrial wave (f wave).

Fig 4 ICa,L and APD in 18 m C57BL/6 mice with or without curcumin treatment()A:Representative traces of ICa,L and corresponding current-voltage relationships in atrial myocytes [n=10-13/3-4 (atrial myocytes/mice)]；B:Voltage dependence activation,inactivation and time course of recovery for ICa,L [n=10-21/3-4 (atrial myocytes/mice)]；C:Representative traces of APD in atrial myocytes [n=9-10/3-4 (atrial myocytes/mice)].APA,APD90,APD70,APD50 were calculated.*P<0.05,**P<0.01 vs 18 m group,##P<0.01 vs high curcumin group.APA:action potential amplitude.

4 討論

本研究中，我們主要發現：(1)與年輕組相比，老年小鼠左心耳組織中p300和衰老信號通路p53/p21表達明顯增加，而鈣通道蛋白Cav1.2表達明顯減少。左心房心肌細胞發生電重塑，表現為ICa,L明顯降低和APD明顯縮短。老年小鼠房顫的可誘發性明顯增加。(2) p300抑制劑-姜黃素干預后，可使老年小鼠心房肌細胞的電重塑明顯改善，APD延長，并可明顯降低老年小鼠的房顫可誘發性。

細胞衰老是指增殖中的細胞，細胞周期停在G1期，是對應激的一種反應；主要表現為細胞變得肥大，端粒酶縮短，衰老相關蛋白p53、p21表達增加，衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype)表達增加[9]。既往研究認為心肌細胞作為終末細胞，不會發生增殖，但是近年來的研究表明，心肌細胞可以緩慢增殖，并可通過干細胞進行部分更新，亦可出現衰老[10]；多種心血管疾病如動脈粥樣硬化、心力衰竭和AF都與衰老密切相關[3]。有研究表明，老年小鼠心臟線粒體比年輕小鼠產生更多的ROS，機體內氧化還原平衡能力下降，AF易感性增加[11]。衰老心肌中肌漿網鈣含量減少以及鈣瞬變幅度降低，Ca2+-ATP酶(SERCa2a)表達減少[5,12]。此外，衰老心臟中，成纖維細胞增生替代丟失的心肌細胞，參與衰老相關結構重塑[13]。然而，目前關于衰老對心房肌細胞電重塑影響的機制研究尚不明確。

轉錄輔激活因子p300是一種細胞內普遍存在的核磷酸蛋白，具有組蛋白乙酰轉移酶活性，在細胞增殖、凋亡和胚胎發育中起重要作用[6,14-15]。研究發現，p300純合突變小鼠發育遲緩，出現較高的早期胚胎死亡率。與野生型胚胎細胞相比，p300-/-突變型心臟組織中肌球蛋白重鏈(MHC)和α-肌動蛋白表達顯著減少，并伴有心包積液等致命心血管疾病的風險[16]。研究還表明，p300參與細胞衰老的調控，p300通過乙酰化來調節p53的活性，進而參與生長抑制因子2(inhibitor of growth protein 2)誘導的復制性衰老[17]。在人肺成纖維細胞中p300的耗竭可以延緩細胞的衰老，p300過表達明顯抑制細胞的增殖[7]。另外，研究表明，在心衰患者中，p300參與心肌細胞內鈣離子的調控。且在小鼠心衰模型中，p300表達明顯增加，并通過乙酰化SERCA2a抑制其功能，引起細胞內鈣離子穩態失衡和心肌功能障礙[8]。本研究中，我們發現與年輕組小鼠相比，老年小鼠心房組織的p300表達明顯增加，衰老信號通路激活，同時出現L型鈣通道蛋白Cav1.2的表達降低，心房肌細胞出現電重塑。而給予姜黃素干預，可逆轉上述變化，提示p300可能參與心房肌細胞電重塑的病理過程。既往研究表明，姜黃素具有雙向劑量反應，低劑量姜黃素具有明顯的抗炎、抗衰老作用，高濃度姜黃素反而促進細胞衰老[18]。在本研究亦發現，兩種不同劑量的姜黃素都能延長老齡小鼠心房肌細胞ICa,L，低劑量組優于高劑量組，提示低劑量的姜黃素可能可以更好的改善衰老所致心房電重塑。姜黃素可減少快速心房起搏誘導老年小鼠的房顫發生率，提示拮抗p300可能是潛在的衰老導致房顫的治療靶點。

因此，本研究證實了p300在衰老相關心房肌電重塑中發揮重要作用，其表達增加可導致心房組織衰老信號通路的激活，以及心房肌細胞的電重塑，最終發生房顫。