維生素C對不同亞型甘氨酸受體功能的影響

徐 延，鄒桂昌，左 欣，熊 偉

(中國科學技術大學 生命科學與醫學部、生命科學學院，安徽 合肥 230022)

維生素C(vitamin C，VC)也稱抗壞血酸，可以通過血腦屏障或細胞膜上的2型鈉離子依賴性維生素C轉運體(sodium-dependent vitamin C transporter-type 2，SVCT2)進入腦內及神經細胞中，并且腦中VC的濃度水平高于其它器官中VC的濃度水平[1]，這說明了VC可能對神經系統有著重要的生物學意義。如VC可以影響神經元的發育和髓磷脂的形成，另外有研究指出VC對Ⅰ型多巴胺受體、Ⅱ型多巴胺受體以及N-甲基-D天冬氨酸受體等多種膜蛋白的功能都有影響[1-3]。

神經系統中有兩種重要的抑制性的神經遞質，分別為甘氨酸(glycine，Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)[4]。其中，Gly特異性的受體——甘氨酸受體(glycine receptor，GlyR)在中樞神經系統中分布廣泛且大量存在于脊髓、腦干中。GlyR主要由兩種亞基構成，分別為α和β，到目前為止發現α亞基存在多種亞型，而β亞基只有一種亞型。根據組成GlyR的α亞基的亞型不同，可以將GlyR分為4種亞型，分別為α1、α2、α3、α4亞型(GlyRα1、GlyRα2、GlyRα3、GlyRα4)[5-6]。現已發現很多物質都可以調節GlyR的功能，例如大麻素、酒精、鋅離子等[7]。然而，目前尚無VC對GlyR調節作用的報道。鑒于兩者在中樞神經系統中的重要性，本實驗采用電生理技術，探究VC對GlyR所介導的電流的影響，以期闡明VC與GlyR之間的關系。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料NaCl、KCl、CaCl2、Glucose、HEPES、MgCl2、Vitamin C、Glycine均購于Sigma。DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle Media)、胎牛血清購于HyClone。胰酶購于Life Technologies。LipofectamineTM2000購于Invitrogen。玻璃電極B15024F購于武漢微探科學儀器有限公司。

1.2 溶液配制細胞外液(mmol·L-1)：140 NaCl,5 KCl,2 CaCl2,1 MgCl2,10 Glucose、10 HEPES，pH用NaOH調至7.4。電極內液(mmol·L-1)，140 CsCl,4 MgCl2,10 EGTA,10 HEPES,0.5 Na-GTP、2 Mg-ATP，pH用CsOH調至7.2。含血清細胞培養基：體積占比0.9的DMEM，體積占比0.1的純胎牛血清，體積占比0.01的雙抗(青霉素，鏈霉素)。

1.3 細胞培養和質粒轉染實驗中所用細胞為HEK-293T，細胞培養方法參照文獻[8-9]和實驗室以往經驗，使用含血清的細胞培養基在37 ℃，5 % CO2細胞培養箱中培養。轉染質粒前，挑選細胞生長密度合適的細胞進行轉染。瞬時轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，將1 μg編碼GlyR(野生型或突變型)和1 μg編碼綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的質粒以共轉的形式轉入細胞中。細胞處理6 h后，換液繼續培養。轉染后2 d，便可進行相關實驗檢測。

1.4 單細胞膜片鉗記錄在進行電生理記錄前2 h，將細胞用胰酶處理成單個懸浮細胞后，加入含血清的細胞培養基在合適的培養條件下培養，待細胞重新貼壁后使用。電生理記錄過程中需要將細胞置于細胞外液中，并向電極中加入適量的電極內液，電極(外徑1.50 mm，內徑0.84 mm)是在MODEL P-1000電極拉制儀中拉制而成，拉制后的電極需保證入水電阻在3-4 MΩ之間。膜片鉗實驗在OLYMPUS倒置熒光顯微鏡的觀察下進行，使用電極封接吸破細胞形成全細胞記錄方式后，需要將細胞從皿底抬升至適當高度，然后使用Warner公司的步進電極驅動的給藥系統為細胞施加藥物，然后使用Axopatch 200B放大器在全細胞模式下記錄GlyR在Gly刺激下所介導的電流大小，整個全細胞模式的記錄過程中，細胞膜電位鉗制在-60 mV(在上述參數和條件下記錄到的電流一般為氯離子電流[10-12])，最后使用軟件pClamp 10.4獲取數據。

2 結果

2.1 維生素C對甘氨酸受體不同亞型功能的增強效果首先，我們分別在HEK-293T細胞中轉染表達GlyR的不同亞型(GlyRα1、GlyRα2、GlyRα3)的cDNA質粒以及表達綠色熒光蛋白GFP的cDNA質粒，然后我們對發出綠色熒光的細胞進行電生理記錄。實驗中我們首先記錄GlyR在Gly刺激下所誘發的氯離子電流大小(glycine-activated chloride current，IGly)，Gly的濃度為可以激活GlyR介導的最大電流2 %的濃度(concentration for 2% of maximal effect，EC2)。隨后，我們為細胞孵育1 μmol·L-1的VC，每孵育1min，記錄一次IGly，共記錄5 min，然后改為孵育細胞外液以洗脫VC，每孵育1 min，記錄一次IGly，共記錄3 min。實驗結果表明，在1 μmol·L-1VC的作用下GlyRα1所介導的電流大小顯著增強(P<0.05)(Fig1A，B)。而GlyRα2所介導的電流大小在1 μmol·L-1VC的作用下無顯著性變化(Fig 1C，D)。GlyRα3所介導的電流大小在1 μmol·L-1VC的作用下顯著增強(P<0.05)(Fig 1E，F)。

接下來，我們對GlyRα1、GlyRα2和GlyRα3介導的電流大小隨時間的變化率進行了統計。隨著VC孵育時間的增加，GlyRα1和GlyRα3介導的電流逐漸增大。此外，我們發現1 μmol·L-1VC對GlyRα3的功能影響最明顯，對GlyRα1的功能影響次之，而對GlyRα2功能無明顯作用。在停止孵育VC改為施加細胞外液后，這一效果有所下降(Fig 2)。

Fig 1 Effects of 1 μmol·L-1 vitamin C on glycine-activated currents (IGly) in HEK-293T cellsA-F.Representative trace currents and average values of IGly in HEK-293T cells expressing GlyR α1 (A-B),α2 (C-D) and α3 subunits (E-F),n=6.Data are represented as .*P<0.05,**P<0.01 vs control(Time=0 min) based on unpaired t-tests.

Fig 2 Time course of average percentage potentiation of IGly induced by 1 μmol·L-1 vitamin C during a 5-min period of continuous incubation and a 3-min period of drug wash out in HEK-293T cells transfected with GlyR α1,α2 and α3 subunits(,n=6).**P<0.01 vs α2 group,##P<0.01 vs α1 group.

以上結果表明，1 μmol·L-1的VC可顯著增強GlyRα1亞基和GlyRα3亞基的功能，而對GlyRα2亞基功能的作用十分微弱。并且GlyRα3亞基對VC的作用最為敏感。

2.2 維生素C對甘氨酸受體功能的增強效果的量效關系我們首先記錄轉染了GlyR不同亞型的細胞在孵育VC前的IGly，然后分別對細胞孵育不同濃度的VC，同時記錄IGly。結果表明，GlyRα1所介導的電流大小在不同濃度VC的作用下均有不同程度的增強(Fig 3A)，并且VC濃度越高，VC對GlyRα1功能的增強效果越明顯(Fig 3B)。GlyRα3的實驗結果與GlyRα1的實驗結果相類似，但VC對GlyRα3功能的增強效果明顯大于對GlyRα1功能的增強效果，如在0.01 μmol·L-1VC作用下，VC對GlyRα1功能的作用十分微弱，統計數值為(2.5±4.5)%，而VC對GlyRα3功能的增幅已經達到了(109.1±12.3)%(Fig 3E，F)。與GlyRα1，GlyRα3不同的是，VC為10 μmol·L-1時，才對GlyRα2功能表現出微弱的增強效果，增幅為(44.9±8.6)%(Fig 3C，D)。

以上結果顯示，VC對GlyR功能的增強效果存在著量效關系。與上述結果類似的是，GlyRα3亞基對VC的作用更為敏感。

2.3 孵育磺吡酮不影響維生素C對甘氨酸受體的增強效果研究表明，VC可以通過細胞膜上的SVCT2進入細胞中。接下來的實驗中我們參考前人的實驗方法[13]，對轉染了GlyRα3的細胞施加1 mmol·L-1SVCT2的特異性抑制劑磺吡酮(sulfinpyrazone，SE)以抑制SVCT2的功能，防止VC進入細胞內，然后再孵育10 μmol·L-1的VC，并記錄IGly。我們發現，孵育SE并不會影響VC對GlyR功能的增強效果(Fig 4B)。

2.4 維生素C對甘氨酸受體突變體的作用為了尋找VC作用于GlyR的具體位點，我們對GlyR不同亞型的跨膜序列進行了比對，根據VC對不同亞型GlyR功能增強效果的不同(VC對GlyRα1,GlyRα3功能存在增強效果，而對GlyRα2無增強效果)，我們最終在GlyR第3跨膜結構域找到了相應位點，即第296位的氨基酸(在該位點α1，α3為絲氨酸S296，α2為丙氨酸A296)(Fig 5A)。為了驗證該位點是否的確是VC的作用位點，我們以GlyRα3為例，將其第296位的絲氨酸突變為丙氨酸(GlyRα3 S296A)，并將其質粒轉入HEK-293T細胞中，然后再孵育10 μmol·L-1的VC，并記錄IGly。結果顯示，與野生型GlyRα3相比，10 μmol·L-1VC對突變體GlyRα3 S296A介導的電流大小的增強效果明顯下降(P<0.05)(Fig 5B，C)。

Fig 3 Effects of different concentrations of vitamin C on function of various subtypes of GlyRs(A-F) Trace records of IGly activated by EC2 glycine and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly in HEK-293T cells expressing GlyR α1 (A-B),α2 (C-D) and α3 subunits (E-F) before and after a 5-min continuous incubation with VC at different concentrations,n=6.**P<0.01 vs control(VC=0.01 μmol·L-1),##P<0.01 vs control(VC=0.1 μmol·L-1).

Fig 4 Effects of SVCT2 blocker sulfinpyrazone on vitamin C induced potentiation of GlyRs(A-B) Trace records of IGly activated by EC2 glycine (A) and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly (B) in HEK-293T cells expressing GlyR α3 subunits with or without preincubation of 1 mmol·L-1 sulfinpyrazone,a SVCT2 inhibitor,n=6.

Fig 5 Effects of S296A mutation on vitamin C potentiation of GlyRα3A.Amino acid alignment of the TM3 region flanking S296 (α3) or equivalent residues in the α1 and α2 subunits.(B-C) Trace records of IGly activated by EC2 glycine (B) and bar graphs of VC induced potentiating effect on IGly (C) in HEK-293T cells expressing wild-type (WT) and S296A mutant GlyR α3 subunits,n=6.**P<0.01 vs WT group.

以上結果表明，VC可能作用在GlyR的跨膜片段上，且第3跨膜片段的第296位的氨基酸在該相互作用中起關鍵作用。

3 討論

本實驗中，通過在人工培養的HEK-293T細胞中轉染表達GlyR的cDNA質粒，獲得細胞膜上含有GlyR的HEK-293T細胞，然后采用單細胞膜片鉗技術記錄GlyR所介導的電流大小。實驗中轉染GlyR的HEK-293T細胞系，細胞膜邊緣清晰、完整且細胞立體感強，說明細胞狀態良好。電生理記錄過程中，微玻璃電極與細胞膜之間易形成高阻封接，封接電阻平均大于1 GΩ，說明膜片鉗封接穩定，所得電生理數據可靠。

GlyR是大型Cys-loop超家族的成員。激活后，GlyR可以選擇性的通透氯離子，進而導致神經元超極化和介導中樞神經系統的抑制性的神經信號傳遞[6,14]。GlyR功能正常與否對生物體有著巨大的影響，如家族性驚厥的患者中，GlyR均有不同程度的功能紊亂，這將引起患者肌肉反復抽搐或類似癲癇的癥狀[15]。

VC對中樞神經系統中多種離子通道的功能都有調節作用，如研究發現VC可以降低N-甲基-D-天冬氨酸受體激活后對神經元興奮性的影響；VC可以通過清除胞外的谷氨酸進而降低谷氨酸受體激活后對細胞產生的毒性作用；VC還可以抑制多巴胺受體的功能[1]。但目前VC與GlyR之間的聯系還尚不明確。本研究發現，VC可以增強GlyR的功能，且這一效果與VC濃度之間存在量效關系，這說明VC水平紊亂可能會引起GlyR功能的障礙，反之，通過調節中樞神經系統中VC的濃度水平來得以緩解。

綜上所述，VC可以增強GlyR的功能，其增強效果對于不同亞型的GlyR都各不相同，并且這一作用可能并非是由于VC進入細胞內而產生的。本工作有助于加深對VC在中樞神經系統中生物學意義的認識，也為進一步研究VC與GlyR之間的關系提供實驗依據。