海蓬子皂苷甲調控SHP/STAT信號通路抗肝癌的研究

管福琴，單 宇，陳 雨，王奇志，李林蔚，佟海英，馮 煦,

(1.江蘇省中國科學院植物研究所/中山植物園，江蘇省植物資源研究與利用重點實驗室，2.江蘇省中國科學院植物研究所/中山植物園，江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014)

自2000年以來，肝癌的發病率和致死率出現明顯的上升態勢，成為威脅人類健康的重要因素[1]。信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)參與調控腫瘤的細胞凋亡、增殖分化、血管新生、侵襲轉移和免疫逃避，其中STAT3和STAT5的研究最多[2]。臨床研究發現，60%左右的肝癌組織中存在p-STAT3高表達，且其與肝癌的病理分級和臨床分期相關[3]。含 SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶(SH2-containing protein tyrosine phosphatase，SHP)屬于非受體蛋白酪氨酸磷酸酶家族，是許多信號通路的負性調節因子。已有研究證實，SHP-1和SHP-2可使STAT3蛋白705位酪氨酸殘基去磷酸化從而抑制STAT3信號傳導，并在多種腫瘤中發揮作用[4]。在抗腫瘤藥物研究中，天然產物取得了顯著的療效。海蓬子皂苷甲(bigelovii A，BA)是一種30-降齊墩果烷型五環三萜皂苷，該化合物是本課題組前期從海蓬子中分離并鑒定得到的[5]。研究結果表明，BA能夠促使人乳腺癌細胞MCF7和人白血病細胞HL-60發生細胞凋亡[6-7]，誘導MCF7細胞發生保護性自噬[8]，同時BA還具有治療脂多糖引起的急性肺損傷的潛力[9]。本研究以人肝癌HepG2細胞為研究對象，探討BA抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用，及其對STAT和SHP信號通路的影響，為開發利用海蓬子奠定理論基礎。

1 材料

1.1 細胞人肝癌HepG2細胞，購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 試劑BA，純度>98%，由本課題組分離得到；胎牛血清，蘭州榮曄生物科技有限責任公司；DMEM培養基和蛋白酶抑制劑，Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶、噻唑藍四唑藍(Thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)、放射免疫沉淀法(Radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、預染蛋白Marker等均購自碧云天公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)，Peprotech公司；過釩酸鈉Sigma公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色試劑盒,美國BD公司；抗體和ECL發光液,美國Cell Signaling公司。

1.3 儀器二氧化碳培養箱(Thermo 6500，美國Thermo公司)、生物安全柜(NapFLOW 1200，美國Thermo公司)；離心機(5804R，德國Eppendorf公司)；熒光倒置顯微鏡(IX51，日本Olympus公司)；酶標儀(Infinite M200，美國Tecan公司)；流式細胞儀(Accuri C6，美國BD公司)；化學發光儀(5200Multi，天能)。

2 方法

2.1 細胞培養HepG2細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

2.2 細胞存活率測定將處于對數生長期的HepG2細胞以5×107個·L-1密度接種于96孔培養板，每個孔100 μL。然后用BA(5、10、20、40 μmol·L-1)處理，每組設置3次重復。24、48、72 h后，向各孔中加10 μL MTT(5 g·L-1)，培養箱中孵育4 h后棄去上清，加入DMSO振搖10 min，用酶標儀測定OD570。

通過細胞增殖抑制率公式，計算出細胞增殖抑制率：

細胞生長抑制率/% =(1-實驗組OD值/細胞對照組OD值)×100%

2.3 PI單染法定量檢測細胞凋亡取對數生長期細胞6×105個接種于6孔板，用BA(10、20、40 μmol·L-1)處理細胞24 h，并用PBS洗滌。隨后收集細胞，然后邊振搖邊滴加70%預冷乙醇，共1 mL，4 ℃固定過夜。3 000 r·min-1、5 min，離心收集細胞。加500 μL PI重新懸浮細胞，37 ℃ 培養箱避光染色15 min，流式細胞儀檢測、分析。

2.4 Western blot法檢測STAT和SHP信號通路蛋白的表達取對數生長期細胞按照5×105個/孔接種于6孔板，CO2培養箱中過夜培養。檢測STAT3和STAT5蛋白表達時，次日用IL-6刺激細胞15 min，加入不同濃度的BA(10、20、40 μmol·L-1)處理5 h或用20 μmol·L-1BA處理1、2、4、6、8 h。檢測是否有磷酸酶參與時，次日用過釩酸鈉(25、50、100 μmol·L-1)和20 μmol·L-1BA同時處理HepG2細胞5 h，再用IL-6刺激細胞15 min。檢測SHP-1和SHP-2蛋白表達時，次日用20 μmol·L-1BA處理0.5、1、2、4、6 h。然后均提取細胞總蛋白并檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，封閉液封閉1 h，一抗4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育1 h后，ECL發光液顯色，于化學發光儀中掃描。

3 結果

3.1 BA誘導HepG2細胞凋亡以HepG2細胞作為人肝癌細胞的模型，研究不同濃度的BA(5-40 μmol·L-1)作用不同時間(24、48、72 h)對HepG2的細胞毒作用。結果顯示，隨著BA濃度的增加，細胞抑制率逐漸上升，且呈現很好的時間依賴關系(Fig 1)。PI單染檢測結果顯示(Fig 2)，20和40 μmol·L-1BA作用HepG2細胞24 h，sub-G1峰的比例升高，與對照組相比，有明顯差異，表明細胞產生了凋亡。

Fig 1 Cell growth of HepG2 cells inhibited by BAHepG2 cells were treated with 5,10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 24,48 and 72 h,and then subjected to MTT assay.**P<0.01 vs control.

Fig 2 Apoptosis of HepG2 cells induced by BAHepG2 cells were treated with 10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 24 h,after which the cells were analyzed for DNA content by flow cytometry.

3.2 BA抑制STAT3和STAT5磷酸化激活IL-6是一種細胞生長因子，能使細胞中STAT3和STAT5磷酸化激活。如Fig 3所示，25 μg·L-1的IL-6刺激HepG2細胞15 min，可誘導p-STAT3 和p-STAT5表達，其中p-STAT3表達更高；采用10、20、40 μmol·L-1BA作用5 h后，BA可同時抑制IL-6誘導的STAT3和STAT5的磷酸化；而采用20 μmol·L-1BA作用1、2、4、6、8 h后，BA時間依賴性地抑制了IL-6誘導的STAT3和STAT5磷酸化。對于STAT3的磷酸化，BA作用6 h后效果明顯；對于STAT5的磷酸化，僅作用1 h即可抑制，作用6 h幾乎完全抑制。

Fig 3 IL-6-induced activation of STAT3 and STAT5 suppressed by BA A and C:HepG2 cells were treated with 10,20 and 40 μmol·L-1 BA for 5 h.B and D:HepG2 cells were treated with 20 μmol·L-1 BA for various lengths of time.After induced by IL-6 for 15 min,whole-cell extracts were processed for Western blot analysis.

3.3 BA抑制SHP-1和SHP-2BA單獨作用HepG2細胞顯著抑制了IL-6誘導的STAT3的磷酸化，但當BA與酪氨酸磷酸酶抑制劑過釩酸鈉同時作用HepG2細胞后，BA對STAT3磷酸化的抑制作用被過釩酸鈉逆轉(Fig 4A)。以上結果提示BA可能激活了酪氨酸磷酸酶，從而抑制STAT3的磷酸化。SHP-1和SHP-2是酪氨酸磷酸酶，參與調控STAT3蛋白去磷酸化。Fig 4B結果表明，20 μmol·L-1的BA作用HepG2細胞0.5 h，即可激活SHP-1和SHP-2的表達，且SHP-2的激活時間能夠持續4 h。該結果表明BA通過激活SHP-1和SHP-2，從而使p-STAT3表達下降。

Fig 4 SHP-1 and SHP-2 in HepG2 cells activated by BA A:HepG2 cells were pretreated with 25,50,100 μmol·L-1 sodium pervanadate and 20 μmol·L-1 BA for 5 h,then induced by IL-6 for 15 min,after which whole-cell extracts were processed for Western blot analysis.B:HepG2 cells were pretreated with 20 μmol·L-1 BA for various lengths of time,after which whole-cell extracts were prepared and analyzed for SHP-1 and SHP-2.

4 討論

五環三萜皂苷在自然界種類繁多，分布廣泛，資源豐富。近年來研究發現，一些五環三萜皂苷具有很好的抗腫瘤作用，呈現多部位、多環節、多靶點的特點[10]。本研究以人肝癌 HepG2 細胞為研究對象，探討五環三萜化合物BA抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡的抗腫瘤效應。MTT 實驗結果表明，BA對人肝癌 HepG2 細胞增殖有顯著的抑制作用；流式單染凋亡檢測發現BA能夠誘導HepG2 細胞出現亞二倍體峰，具有劑量依賴性。上述結果表明，BA通過誘導細胞凋亡發揮抗腫瘤效應。

STAT 活化表達于肝臟腫瘤細胞中，參與調控肝臟腫瘤的形成、增殖、侵襲、轉移等諸多環節，是若干致癌信號轉導過程的匯合點，與惡性腫瘤的發生及發展密切相關[2]。白介素6(IL-6)是一種細胞生長因子，可誘導STAT3信號通路的激活，促進細胞的惡性轉化[11]。一些已知的植物來源的天然化合物可有效抑制STAT3的激活，如熊果酸[12]、吳茱萸堿[13]、牛蒡子苷元[14]。本研究結果顯示，隨著BA濃度增高，IL-6活化的p-STAT3、p-STAT5 蛋白的表達量明顯減少，說明BA可能是通過下調STAT 信號通路中 STAT3、STAT5的表達，誘導肝癌細胞凋亡的。

我們進一步發現，BA抑制STAT3和STAT5的作用涉及蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。許多PTPs與STAT信號相關，包括SHP-1、SHP-2、T-cell PTP、PTEN、PTP-1D、CD45、PTPe[15]。SHP-1和SHP-2可以負調控JAK/STAT信號通路[16]。本研究發現，BA刺激SHP-1和SHP-2蛋白表達增加與STAT3、STAT5磷酸化下調相關。除了蛋白酪氨酸磷酸酶，STAT3激活負調控也通過其他機制，這些機制包括SOCS、PIAS、泛素依賴的蛋白酶體降解和Smad4[17]。這些抑制蛋白是否參與BA誘導的STAT3去磷酸化需要進一步研究。

綜上所述，BA通過激活SHP-1/SHP-2，下調STAT3/STAT5信號傳導途徑，從而誘導肝癌細胞凋亡。另外，SHP-1/SHP-2 和STAT3/STAT5軸參與調節肝癌細胞凋亡這一項發現，完善了對肝癌發病機制的理解，提供了肝癌治療的潛在靶點。